内脂素对肾小球系膜细胞外基质表达的影响

陈林 黄国良

[摘要] 目的 探讨内脂素对大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）细胞外基质表达的影响。方法 体外培养GMCs，随机分为对照组和不同浓度内脂素（25、50、100、200 ng/mL）干预组，逆转录PCR（RT-PCR）检测GMCs纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA，Western印记测定FN、COLⅠ蛋白。结果 不同浓度内脂素干预GMCs 24 h后，细胞FN及COLⅠ的mRNA和蛋白表达均较对照组增多（P<0.05），且随着内脂素浓度增加，其表达呈逐渐增加的趋势（P<0.05）。结论 内脂素呈一定的浓度依赖性促进GMCs细胞外基质表达，可能参与糖尿病肾病的发生发展。

[关键词] 糖尿病肾病；内脂素；纤维连接蛋白；Ⅰ型胶原

[中图分类号] R589 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2018）10（b）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of visfatin on the expression of extracellular matrix in rat mesangial cells （GMCs）. Methods GMCs were cultured in vitro and randomly divided into control group and intervention group with different concentrations of visfatin（25 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL， 200 ng/mL）. Reverse transcription-PCR（RT-PCR） was used to detect GMCs fibronectin（FN） and type I collagen，（COLI） mRNA，Western blotting to determine FN，COLI protein. Results After treatment with different concentrations of lipoprotein for 24 hours， the mRNA and protein expressions of FN and COLI increased compared with the control group（P<0.05），and the expression increased gradually with the increase of visfatin concentration（P<0.05）. Conclusion The visfatin promotes the expression of extracellular matrix of GMCs in a concentration-dependent manner， which may be involved in the development of diabetic nephropathy.

[Key words] Diabetic nephropathy； Visfatin； Fibronectin； Type I collagen

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是以系膜细胞增生、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）沉积及肾小球硬化為主要特征。系膜细胞ECM成分包括胶原纤维（Collagen，COL）、纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）、层粘连蛋白等。内脂素是新近发现的一种细胞因子，具有促炎作用[1-2]。有研究显示DN患者血浆内脂素水平明显升高[3]，体外实验[4-5]亦表明，内脂素还具有促纤维化作用，可能参与DN发生发展。国内关于内脂素与DN的关系研究报道较少。该研究旨在通过体外培养GMCs，观察内脂素对GMCs ECM表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

大鼠肾小球系膜细胞株（武汉大学中国典型培养物保藏中心），重组内脂素（美国Biovision公司），逆转录试剂盒（加拿大Fermentas公司），PCR 引物合成（上海生工股份有限公司），FN小鼠单抗、COLⅠ小鼠单抗（美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 采用DMEM低糖培养液培养GMCs，置于37℃、5%CO2培养箱中，当细胞接近亚融合状态时改用无血清培养液培养12 h 以同步化，再随机分为：对照组及不同浓度内脂素（25、50、100、200 ng/mL）干预组，孵育24 h。

1.2.2 RT-PCR检测FN和COLⅠmRNA表达 RNAiso Plus提取总RNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增FN、COLⅠmRNA基因片段。FN引物：上游 5-CAGTTTGTGGAAGTGACCGA-3，下游 5-TGGAGGTTAGTGGGAGCATC-3；COLⅠ引物：上游 5-CATCCACAAGCGTGCTGTAGGTG-3；下游 5-TGCCGTGACCTCAAGATGTGCC-3；β-Actin引物：上游 5-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3，下游 5-TCTCTTGC TCGAAGTCTAGG-3。Image J软件计算目的基因/内参灰度值。

1.2.3 Western印迹检测FN和COLⅠ蛋白表达 裂解液充分裂解细胞，4℃ 14 000 r/min离心15 min，取上清。SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗中室温孵育1 h，胶片显影。Image J 软件分析目的蛋白/内参蛋白灰度值。

1.3 统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内脂素对GMCs FN mRNA表达影响

不同浓度内脂素作用后，GMCs FN mRNA表达增加，均高于对照组（P<0.01）。在25～100 ng/mL浓度范围内，随着内脂素浓度增加，FN mRNA表达逐渐增加（P<0.01），200 ng/mL组与100n g/mL组FN mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 内脂素对GMCs FN蛋白表达影响

各组细胞FN蛋白表达亦高于对照组（P<0.05），与其mRNA表达趋势一致，在内脂素25～100 ng/mL范围，FN蛋白表达也随着内脂素浓度的升高而逐渐增加（P<0.01），200 ng/mL组与100 ng/mL组FN 蛋白表达亦差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.3 内脂素对GMCs COLⅠmRNA表达影响

观察内脂素与GMCs COLⅠmRNA表达的量效关系，发现25 ng/mL内脂素也促进GMCs COLⅠmRNA表达增加（P<0.01），且随着内脂素浓度升高，其COLⅠmRNA表达逐渐增加（P<0.01）。见表2。

2.4 内脂素对GMCs COLⅠ蛋白表达影响

进一步观察内脂素对GMCs COLⅠ蛋白表达的影响，结果显示，与其mRNA表达一致，内脂素亦呈浓度依赖性促进细胞COLⅠ蛋白表达增加（P<0.05）。见图2。

3 讨论

内脂素是新近发现的一种脂肪细胞因子，除在脂肪组织外，在肾脏、心脏和骨骼肌等部位亦表达丰富[6]。许多研究表明，炎症状态下内脂素表达明显增加，其与炎症因子相互作用，级联放大，参与了多种炎症相关性疾病[7]。慢性低度炎症状态是DN进展的因素。Song等[5]通过体外培养大鼠GMCs，发现高糖可刺激GMCs分泌内脂素增多。再给予外源性内脂素刺激GMCs，细胞葡萄糖转运蛋白表达增加，纤维化相关因子分泌增多，肾脏纤维化加速。其他研究亦表明[8]，随着内脂素表达的下调，高糖诱导的GMCs增殖、炎癥及纤维化过程明显被抑制。临床报道显示糖尿病患者血浆内脂素水平明显升高，DN患者血浆内脂素浓度升高更为显著[8]。血浆内脂素水平还与蛋白尿的严重程度呈正相关。这些研究均提示内脂素可能与DN密切相关。该实验通过内脂素对GMCs ECM表达影响的角度为切点，探讨内脂素在DN中的可能作用。

肾小球原有基质成分（如FN）以及非正常肾小球基质成分（如COLⅠ和COLⅢ）表达增多均导致ECM异常沉积。该实验选取FN、COLⅠ作为观察指标，观察不同浓度内脂素对GMCs FN、COLⅠ表达的影响。结果显示25 ng/mL内脂素作用GMCs 24 h，细胞FN 和COLⅠmRNA和蛋白表达均显著上调，且随着内脂素浓度升高，表达呈逐渐增加趋势。提示内脂素呈一定的浓度依赖性促进GMCs FN和COLⅠ表达。

该研究与其它许多体外细胞研究结果相似，内脂素具有显著的促进细胞胶原纤维表达的作用[7，9]；另外还表明内脂素能促进GMCs FN基因和蛋白表达，提示内脂素能刺激GMCs合成大量ECM。高糖是内脂素表达增加的一个重要因素[5，10]。另外对DN患者使用雷米普利治疗，其炎症、内皮细胞功能及蛋白尿均明显改善，并伴有血浆内脂素水平显著下降[11]，表明RAS系统激活也促进内脂素表达。故推测糖尿病患者在高糖刺激及RAS系统激活后，内脂素水平明显升高，而内脂素又进一步激活RAS系统[12]，形成恶性循环，最终促进GMCs纤维化因子表达增加，可能是DN发展中的一个重要环节。

该研究为DN防治提供一个可能的新靶点，但还需体内动物试验进一步研究证实，且内脂素在DN中的可能通路及机制有待深入探讨。

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（收稿日期：2018-07-15）