hsa_circ_RNA0023397和mi 106b在活动性克罗恩病肠黏膜组织中的表达及意义

沈朵，陈洪，李红霞，徐孝新，尹莹

(1.东南大学 医学院，江苏 南京　210009; 2.东南大学附属中大医院 消化科，江苏 南京　210009)

1　材料与方法

1.1　材料

1.2　肠黏膜组织来源

肠道黏膜组织活检标本收集自2014年9月至2017年3月在东南大学附属中大医院住院患者，通过结肠镜及病理学检查确诊为活动期CD的患者40例，其中男性25例，女性15例；最大年龄为60岁，最小年龄为19岁，平均年龄为32.3岁。对照病例选取就诊于我院接受肠镜检查并行肠道黏膜组织活检的健康体检者，经过病理学检查提示为正常组织，总共有40例，其中男性26例，女性14例；最大年龄为55岁，最小年龄为25岁，平均年龄为34.9岁。两组在性别构成比、年龄等一般情况上无显著差别，本研究对象术前均签署知情同意书。

1.3　circRNAs组织芯片检测

1.4　肠黏膜组织中mi 106b的表达情况检测

用TRIzol提取肠黏膜组织总mRNA，逆转录为cDNA，逆转录反应条件:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；用实时定量PCR试剂盒进行检测，反应条件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。每个样品设置3个复孔，PCR反应后，Ct值通过设置固定阈值确定，取3次PCR的结果求平均Ct值。miRNA相对水平通过U6校正。

1.5　肠黏膜组织中ha circ_0023397的表达情况检测

1.6　肠黏膜组织中自噬情况检测

1.7　肠黏膜组织中ATG16L1蛋白表达检测

1.8　统计学处理

2　结　　果

2.1　活动期CD肠黏膜组织中mi 106b的表达情况

2.2　circRNA组织芯片结果及活动期CD患者病变肠道黏膜组织中hsa_circ_0023397的表达情况

本课题组利用环状RNA芯片(Arraystar公司)，对活动期CD病变肠道黏膜的circRNA表达谱进行了筛查(图2)。采用实时定量PCR方法检测40例活动期CD患者病变肠道黏膜组织标本及40例正常对照标本中hsa_circ_0023397的表达水平，发现活动期CD组织中hsa_circ_0023397表达低于健康对照组(P<0.01)(图3A)。此外，统计分析提示，hsa_circ_0023397诊断活动性CD的ROC曲线下的面积为0.844(P<0.01)(图3B)，灵敏度和特异度分别为0.80和0.85。

A.差异表达circRNA的火山图，红点代表差异表达的具有统计学意义的circRNA；B.各样本circRNA谱系聚类分析图，每列代表每个组织样本的表达情况，每行代表每个circRNA,红色表达高表达，绿色代表低表达
图2circRNA芯片检测结果
Fig2ResultsofcircRNAchiptest

A.qPCR 检测结果，bP<0.01，ΔCt值高表示表达量低；B.hsa_circ_0023397的ROC曲线(P<0.01)
图3hsa_circ_0023397在活动期CD患者病变肠道黏膜组织和健康对照两组中的表达水平
Fig3hsa_circ_0023397expressioninintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols

2.3　自噬相关蛋白LC3的表达检测

2.4　CD相关基因ATG16L1蛋白的表达检测

利用Western Blot检测发现，在活动期CD患者肠黏膜中ATG16L1蛋白较健康对照组表达下降(P<0.05)(图5)。

图4活动期CD患者和健康对照肠黏膜中LC3蛋白的表达(aP<0.05)
Fig4ExpressionofLC3proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

图5活动期CD患者和健康对照肠黏膜中ATG16L1蛋白的表达(aP<0.05)
Fig5ExpressionofATG16L1proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

3　讨　　论

[参考文献]

[12] GUO J U,AGARWAL V,GUO H,et al.Expanded identification and characterization of mammalian circular RNAs[J].Genome Biol,2014,15(7):409.

[15] SALZMAN J,GAWAD C,WANG P L,et al.Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J].PLoS One,2012,7(2):e30733.