Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证

赵润然，沈忱悠，严沁，卢春

（南京医科大学病原生物学系，江苏南京211166）

作为进化高度保守的信号通路，Notch通路借助于相邻细胞间受体与配体的通讯，参与细胞分化和组织发育等重要的生物学过程。Notch受体（Notch1～4）与配体（DLL1／3／4、JAG1／2）结合后触发Notch信号，γ-分泌酶识别并切割受体细胞Notch蛋白，释放具有活性的胞内Notch片段（intracellular Notch，ICN）到胞质中。ICN继而转移入核，与转录因子RBP-Jκ结合形成蛋白复合体，激活下游Hes、Hey等转录因子家族基因表达［1－2］。

大量研究表明，Notch信号通路失调在肿瘤发生与发展过程中发挥了重要作用［3－6］，其中包括卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染导致的卡波氏肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）。KSHV又称为人疱疹病毒8型，属于疱疹病毒γ2亚科，由美国学者于1994年在AIDS相关的KS（AIDS-related KS，AIDS-KS）的病损组织中首次鉴定［7］。KSHV感染除了引起KS外，同时还与原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）以及多中心Castleman病（multicentric Castleman′s disease，MCD）的发生密切相关。Notch信号通路不仅参与KSHV潜伏／裂解的转换，而且在KSHV诱导相关肿瘤的形成过程，包括内皮细胞间质转化、血管生成等发挥重要作用［8－9］。

本研究构建了含Notch1受体胞内段基因的ICN重组质粒，包装了表达ICN的重组慢病毒，以期通过过表达ICN激活Notch信号通路，从而探索其对KSHV潜伏感染的PEL细胞增殖能力的影响。

1　材料与方法

1.1　质粒与细胞

真核表达质粒pIP-Flag-ICN和慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen分别由武汉大学蓝柯研究员和黄赞教授惠赠。慢病毒包装系统的包膜质粒pMD2.G以及包装质粒psPAX2为本实验室保存。人胚肾上皮293T细胞培养于含有10%灭活胎牛血清（美国 Gibco公司）的 DMEM培养基（美国 Hyclone公司）中；BCP-1细胞（从PEL中分离的KSHV阳性、EB病毒阴性的B淋巴细胞）培养于含有10%灭活胎牛血清的1640培养基（美国Hyclone公司）中。上述培养基中均加入链霉素（100μg／mL）和氨苄西林（100 U／mL），细胞培养于 37℃、5%CO2培养箱中。

1.2　试剂

PCR所用的高保真酶（Fanta酶）为南京诺唯赞科技有限公司产品；PCR引物由南京擎科有限公司合成；T4连接酶（美国Thermo Scientfic公司）；限制性内切酶NheⅠ与Bam HⅠ（日本TaKaRa公司）；质粒小提试剂盒及凝胶纯化试剂盒（美国Omega公司）；质粒转染试剂 LipofectamineTM2000（美国 Invitrogen公司）；α-微管蛋白抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG以及抗ICN单克隆抗体（南京巴傲得生物科技有限公司）；抗Flag单克隆抗体和抗Hes-1单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；台盼蓝染液为本实验室自行制备。

1.3　方法

1.3.1ICN基因的PCR扩增 根据真核表达质粒p IP-Flag-ICN序列分别设计ICN的上下游引物，上游引物引入NheⅠ限制性酶切位点，下游引物引入Bam HⅠ限制性酶切位点。上游引物序列为5′-CTA（下划线部分为 NheⅠ识别序列），下游引物序列为5′-（下划线部分为Bam HⅠ识别序列）。

1.3.2重组质粒pHAGE-ICN的构建与鉴定 用限制性内切酶NheⅠ和Bam HⅠ双酶切PCR回收产物和慢病毒载体 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen，并运用琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化。纯化后产物用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态细胞大肠埃希菌DH5α。随机选取具有氨苄西林抗性菌落进行扩增，使用质粒小提试剂盒提取重组质粒。双酶切鉴定重组质粒，同时进行核酸序列测定并经DNAssist比对，比对正确后将该质粒命名为pHAGE-ICN。

在6孔板中铺入状态良好的293T细胞过夜。次日，用LipofectamineTM2000将pHAGE-ICN质粒及其对照pHAGE质粒分别转染入汇合度达到70%～80%的293T细胞中，于转染6 h后更换为完全培养基，48 h后提取细胞总蛋白，取10μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后经5%脱脂牛奶封闭，再根据蛋白大小将PVDF膜以含目的蛋白（如α-微管蛋白、Flag标签蛋白、内源性ICN蛋白以及Notch通路下游Hes-1蛋白）的一抗孵育过夜。第2天以相应的二抗孵育，随后通过化学发光法进行检测。

1.3.3重组慢病毒ICN的包装与滴度测定 在直径为10 cm的细胞培养皿中铺入状态良好的293T细胞过夜。次日，用LipofectmineTM2000将包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G与重组质粒pHAGEICN或其对照pHAGE质粒共同转染入汇合度达到70%～80%的293T细胞中，10 h后更换为完全培养基。于48 h和72 h收取细胞培养上清液并经0.45 μm滤器过滤，将所获得的重组慢病毒分别命名为Lv-ICN和Lv-Mock。

采用病毒梯度稀释法稀释Lv-ICN和Lv-Mock病毒液，并感染293T细胞。48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达，计数绿色荧光细胞个数，每个绿色荧光细胞计为1个转导单位（transducing units，TU）。病毒滴度计算公式如下：病毒滴度（TU／mL）＝绿色荧光细胞数×病毒液稀释倍数／病毒液体积。

1.3.4重组慢病毒介导ICN在BCP-1细胞中的表达 取约1×106个状态良好的BCP-1细胞铺入6孔板中，以相同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的Lv-ICN及其对照Lv-Mock病毒进行感染。感染4 h后更换为完全培养基继续培养。荧光显微镜观察到 GFP表达后提取细胞总蛋白，按方法“1.3.2”中所述步骤进行蛋白质印迹实验。

1.3.5细胞计数法检测ICN过表达对BCP-1细胞增殖能力的影响 将Lv-ICN及其对照Lv-Mock感染的BCP-1细胞铺入12孔板中（每孔约1×105个细胞），每组设立3个复孔。分别在铺板0、1、2、3天后收集细胞悬液，将0.1%台盼蓝染液与细胞悬液以1∶1进行混合，染色3 min后计数未着色的活细胞数量。

1.4　统计学方法

应用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　ICN基因的PCR扩增

以真核表达质粒pIP-Flag-ICN为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，在约2 445 bp位置可见与预期大小一致的目的片段（图1）。

图1　PCR扩增ICN基因

2.2　重组质粒pHAGE-ICN的鉴定

NheⅠ、Bam HⅠ双酶切重组质粒pHAGE-ICN，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在7 740 bp和2 445 bp处出现明显条带（图2），分别代表慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen和ICN基因。重组质粒序列测定后经DNAssist软件比对证实，插入的ICN基因片段与基因库中已登记的序列一致。

图2　重组质粒pHAGE-ICN的双酶切鉴定

将重组质粒pHAGE-ICN及对照pHAGE质粒分别转染293T细胞，蛋白质印迹检测显示转染重组质粒pHAGE-ICN后不仅可以检测到标签蛋白的表达，而且还可以提高内源性ICN蛋白以及Notch通路下游重要转录因子Hes-1蛋白的表达水平（图3）。提示重组质粒pHAGE-ICN构建成功。

图3　重组质粒转染293T细胞后Notch信号通路相关蛋白的表达

2.3　ICN重组慢病毒的包装及滴度测定

包装质粒、包膜质粒与pHAGE-ICN质粒或其对照质粒共同转染入293T细胞，48 h后可以观察到超过90%的细胞中有GFP表达（图4）。

图4　重组质粒转染293T细胞后GFP的表达（×100）

按照不同倍数稀释病毒液后感染293T细胞进行病毒滴度测定，48 h后可以观察到不同程度的GFP表达（图5）。经荧光计数法测得含有ICN基因的重组慢病毒的滴度约为2×107TU／mL，对照慢病毒的滴度约为3×107TU／mL。

图5　不同稀释度的ICN重组慢病毒感染293T细胞后GFP的表达（×100）

2.4　ICN过表达对BCP-1细胞增殖的影响

以相同MOI的Lv-ICN及其对照Lv-Mock感染BCP-1细胞，观察到GFP后提取细胞总蛋白进行蛋白质印迹。结果显示，Lv-ICN感染后可在预期大小处出现特异性的标签蛋白条带，同时内源性ICN蛋白以及Notch通路下游Hes-1蛋白的表达水平明显提高（图6A），表明重组慢病毒成功介导ICN蛋白在BCP-1细胞中的过表达，且感染Lv-ICN后有效活化了BCP-1细胞中的Notch通路。

台盼蓝染色细胞计数法结果显示，从铺板第3天起，经Lv-ICN感染的BCP-1细胞增殖能力比对照组显著增强（P＜0.05，图6B）。提示重组慢病毒介导ICN蛋白的过表达能够增强BCP-1细胞的增殖能力。

图6　重组慢病毒介导的ICN蛋白在BCP-1细胞中的功能验证

3　讨论

病毒感染后能够依赖细胞信号通路在宿主细胞内进行感染和复制，而细胞信号通路的改变则是宿主对病毒感染的反应以及病毒修饰感染环境的综合结果。类似地，KSHV可以通过调控Notch信号通路服务于自身生命周期以及诱导相关肿瘤的发生。研究发现，在KS病灶组织及KSHV感染细胞中，Notch信号通路的多种组分呈现高水平表达［10］，其中包括 Notch1、Notch2、Notch3、JAG1等［11］。在 PEL细胞中，KSHV编码的潜伏相关核抗原（latency-associated nuclear antigen，LANA）通过阻止ICN的泛素化降解，提高ICN在细胞中的稳定性和表达水平，并增强细胞的增殖能力［12］。同时，KSHV感染B细胞后还可以通过促进ICN的表达，上调Cyclin D1从而加速细胞的增殖［13］。因此，KSHV感染后活化的Notch信号通路具有促进宿主细胞生长的作用。在PEL细胞中，使用 γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitor，GSI）抑制Notch信号通路可以使细胞维持在G1期并抑制细胞生长。更重要的是，GSI处理后可以减缓小鼠体内 KS肿瘤细胞的生长［14］。提示Notch信号通路可以作为治疗KSHV感染引起的恶性肿瘤的潜在靶点。

目前尚无针对Notch信号通路的特异性激动剂。为此，构建表达特定Notch信号通路组分的表达载体成为最常用的活化Notch信号的方式。Notch受体蛋白由胞外结构域和胞内结构域组成，其蛋白编码序列全长近7.6 kb，一般很难进行完整克隆。由于Notch信号通路发挥生物学功能主要通过ICN［15］，因此对ICN进行选择性克隆是目前研究Notch信号通路的主要方法之一。作为一种常用的分子生物学工具，病毒载体能够通过病毒基因组将遗传物质带入细胞中。目前应用较多的是慢病毒载体，该载体具有容纳的外源性目的基因片段大、包装周期短等特点，且外源性基因插入细胞基因组后能够稳定地持续地表达［16］。鉴于ICN片段较长，且对病毒感染效率要求较高，本文在构建重组质粒pHAGE-ICN的基础上，选择通过慢病毒三质粒包装系统包装了携带ICN基因的重组慢病毒，从而达到激活Notch信号通路的目的。

以表达ICN的重组慢病毒感染含有KSHV的PEL细胞，通过蛋白质印迹证实ICN蛋白得到有效过表达，并且能够促进Notch信号通路下游转录因子的表达。进一步研究发现，过表达ICN能显著增强KSHV潜伏的PEL细胞的增殖能力。提示本研究构建的ICN重组慢病毒可以显著活化Notch通路信号，为后续研究Notch信号通路在KSHV生命周期和相关肿瘤发生中的作用奠定了基础。

［参考文献］

［1］Bray SJ，Gomez-Lamarca M.Notch after cleavage［J］.Curr Opin Cell Biol，2017，51：103－109.

［2］Hahm ER，Chandra-Kuntal K，Desai D，et al.Notch activation is dispensable for D，L-sulforaphane-mediated inhibition of human prostate cancer cell migration［J］.PLoSOne，2012，7（9）：e44957.

［3］Dabral S，Tian X，Kojonazarov B，et al.Notch1 signalling regulates endothelial proliferation and apoptosis in pulmonary arterial hypertension［J］.Eur Respir J，2016，48（4）：1137－1149.

［4］Harbuzariu A，Rampoldi A，Daley-Brown DS，et al.Leptin-Notch signaling axis is involved in pancreatic cancer progression［J］.Oncotarget，2017，8（5）：7740－7752.

［5］Shin HM，Minter LM，Cho OH，et al.Notch-1 augments NF-κB activity by facilitating its nuclear retention［J］.EMBO J，2005，25（1）：129－138.

［6］Tao J，Jiang MM，Jiang L，et al.Notch activation as a driver of osteogenic sarcoma［J］.Cancer Cell，2014，26（3）：390－401.

［7］尚元翠，卢春，秦娣.卡波氏肉瘤病毒K9基因重组慢病毒表达载体的构建及其编码蛋白功能初探［J］.江苏大学学报（医学版），2016，26（6）：461－465.

［8］Carroll KD，Bu W，PalmeriD，etal.Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus lytic switch protein stimulates DNA binding of RBP-Jk／CSL to activate the notch pathway［J］.JVirol，2006，80（19）：9697－9709.

［9］Lan K，MurakamiM，Choudhuri T，et al.Intracellularactivated Notch1 can reactivate Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus from latency［J］.Virology，2006，351（2）：393－403.

［10］DeCotiis JL，Lukac DM.KSHV and the role of Notch receptor dysregulation in disease progression［J］.Pathogens，2017，6（3）：34.

［11］Liu R，Li X，Tulpule A，et al.KSHV-induced Notch components render endothelial and mural cell characteristics and cell survival［J］.Blood，2010，115（4）：887－895.

［12］Lan K，Verma SC，Murakami M，et al.Kaposi′s sarcoma herpesvirus-encoded latency-associated nuclear antigen stabilizes intracellular activated Notch by targeting the Sel10 protein［J］.Proc Natl Acad SciU SA，2007，104（41）：16287－16292.

［13］Lan K，Choudhuri T，Murakami M，et al.Intracellular activated Notch1 is critical for proliferation of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus-associated B-lymphoma cell lines in vitro［J］.JVirol，2006，80（13）：6411－6419.

［14］Lan K，Murakami M，Bajaj B，et al.Inhibition of KSHV-infected primary effusion lymphomas in NOD／SCID mice byγ-secretase inhibitor［J］.Cancer Biol T-her，2009，8（22）：2136－2143.

［15］Kang HG，Kim DH，Kim SJ，et al.Galectin-3 supports stemness in ovarian cancer stem cells by activation of the Notch1 intracellular domain［J］.Oncotarget，2016，7（42）：68229－68241.

［16］王露，翟玮玮，杨向荣，等.慢病毒介导RNA干扰沉默Fas基因在脐带间充质干细胞中的表达［J］.南方医科大学学报，2014，34（10）：1475－1480.