空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素敏感性检测及其耐药机理分析

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弯曲菌是主要的食源性病原菌，主要导致人类细菌性肠炎[1-2]。在欧美等发达国家，弯曲菌病是报道最多的食源性胃肠道疾病，其发病率甚至超过了沙门菌、志贺氏菌以及大肠杆菌O157∶H7[3-5]。弯曲菌病通常是自限性疾病，但是对于免疫力低下及病程迁延不愈的患者进行抗生素的治疗是必须且有效的[6]。氟喹诺酮类药物(如环丙沙星)和大环内酯类药物(如红霉素)是临床上治疗弯曲菌病的首选药物[7]。但是目前弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素耐药严重。2013年，美国CDC将耐氟喹诺酮类和大环内酯类弯曲菌列为影响公共卫生的耐药威胁之一[8]。2017年，WHO将氟喹诺酮耐药弯曲菌列为优先2级(高度耐药)[9]。

研究发现在编码DNA回旋酶的gyrA基因内有一个被称之为热点的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)[10]。在这个区域内发生突变是弯曲菌产生喹诺酮耐药的主要原因。另外研究发现，主动外排系统与多种抗生素的耐药相关，可以造成弯曲菌的多重耐药，也是导致弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素耐药的另一个重要的机制[11]。为进一步了解近年我国不同宿主来源分离菌株喹诺酮类耐药现状及耐药机理机制，本研究通过对近期分离菌株萘啶酸、环丙沙星敏感性的分析以及耐药菌株gyrA基因，gyrB基因的DNA序列分析，获得我国近期分离菌株喹诺酮类抗生素耐药现状及主要耐药机理。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验菌株分离于2015-2017年不同宿主来源234株空肠弯曲菌菌株，其中98株来源于腹泻病人，20株来源于鸡粪，59株来源于牛粪，46株来源于食品动物(鸡肉，鸡胗，鸡肾，鸡肝，猪肉)，11株来源于鸭粪。质控菌株C.jejuni(ATCC33560)为本研究室保存。

1.1.2试剂CAMPYLOBACTER AGAR BASE (Karmali) (CM0935)购自OXOID公司，脱纤维羊血购自北京兰博瑞生物制品有限公司，DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit (250)购自QIAGEN(北京)公司，Gelred 10 000×染料(Cat: 41003, Lot: 11G0127) 购自美国BIOTIUM公司，2×EsayTaq PCR SurperMix(CAT:AS111)购自全式金生物技术有限公司，Trans2K DNA Marker(BM101)购自全氏金生物技术有限公司，Regular Agarose G-10 (LOT:111860)购自法国BIOWEST公司，弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒(ZC-CAMPY-013)购自青岛中创生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌培养及药敏试验将菌株接种于含有 5%脱纤维羊血的Karmali培养基上，置于37 ℃微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2)条件下培养48 h，挑取3代单克隆后增菌[12]。

根据CLSI推荐的弯曲菌琼脂稀释法(Agar Dilution Method)对菌株进行药敏试验。ATCC33560作为质控菌株。37 ℃微需氧培养48 h后读取结果。根据NARMS-2014规定，萘啶酸≤16 μg/mL为敏感，32 μg/mL为中介，≥64 μg/mL为耐药；环丙沙星≤1 μg/mL为敏感,2 μg/mL为中介，≥4 μg/mL为耐药。

1.2.2gyrA和gyrB基因筛查gyrA基因筛查所用的引物：上游引物：5′-ATAGGTCGTGCTTTGCC-3′,下游引物：5′-GCTCTCATCTCTTACTTCAGA-3′，产物长度为700 bp；gyrB基因筛查所用的引物：上游引物5′-ATGGCAGCTAGAGGAAGAGA-3′，下游引物5′-GTGATCCATCAACATCCGCA-3′，产物长度为650 bp。50 μL PCR反应体系：2×EsayTaq PCR SurperMix 25 μL,上游引物(10 μmol/L)2.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)2.0 μL，模板200 ng。按照以下程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并送天一辉远生物科技有限公司测序。

1.2.3统计学分析采用SAS9.4软件对数据进行导入、整理和分析。对不同宿主来源菌株耐药情况进行卡方检验分析，检验水准α=0.05。

2　结　果

2.1药敏试验结果234株空肠弯曲菌中共筛查到218株(93.16%)萘啶酸耐药菌株，其中鸡粪来源菌株耐药率是100.00%，鸭粪来源菌株耐药率是100.00%，腹泻病人粪便来源菌株耐药率是97.96%，食品动物来源菌株耐药率是97.83%，牛粪来源菌株耐药率是77.97%，耐药率差异有统计学意义(P<0.05)，鸭粪和鸡粪来源菌株耐药率最高；211株(90.17%)环丙沙星耐药菌株，其中鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率均为100%，食品动物来源菌株耐药率是95.65%，腹泻病人粪便来源菌株耐药率是91.84%，牛粪来源菌株耐药率是77.97%，耐药率差异有统计学意义(P<0.05)，鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率最高。结果见表1。

表1空肠弯曲菌对萘啶酸和环丙沙星的耐药情况
Tab.1Resistance for nalidixic acid and ciprofloxacin of Campylobacter jejuni

AntibioticsResistantisolates(%)Total(n/T)Humanfeaces(n/T)Chickenfeaces(n/T)Cowfeaces(n/T)Duckfeaces(n/T)Foodanimal(n/T)Nalidixicacid93．16(218/234)97．96(96/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)97．83(45/46)Ciprofloxacin90．17(211/234)91．84(90/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)95．65(44/46)

n, 耐药菌株的数量；T, 检测菌株的总数量

2.2基因测序分析结果选择对萘啶酸(MIC≥64 μg/mL)或环丙沙星(MIC≥4 μg/mL)其中一种药物耐药或者是同时耐药的菌株共102株进行gyrA基因和gyrB基因测序；选取空肠弯曲菌敏感菌株(萘啶酸MIC≤16 μg/mL并且环丙沙星MIC≤1 μg/mL)共27株进行gyrA基因测序。测序结果发现：

2.2.1耐药菌株gyrA基因相关区域测序共发现23个突变位点，其中有义突变5个,分别是Thr-86-Ile，Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg。所有耐药菌株都存在Thr-86-Ile点突变，但所有敏感菌株不存在该点突变。除Thr-86-Ile突变外，耐药菌株在Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg位点也存在有义突变，但这些突变位点均不在喹诺酮类耐药决定区范围内(区间：69-120)[13]。并且与耐药菌株相比，敏感菌株在Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg 3个点也存在有义突变，表明这3个点的突变均可能与耐药无关。gyrA基因突变的详细结果见表2。

2.2.2耐药菌株gyrB基因相关区域测序显示不存在有义突变，92.16%(94/102)的耐药菌株存在Arg-389-Arg突变，89.22%(91/102)的耐药菌株存在Leu-403-Leu突变，但都属于无义突变。

表2耐药及敏感空肠弯曲菌gyrA基因突变特征
Tab.2Mutations in the gyrA for both the resistant and sensitive C.jejuni

MutationResistantisolatesSensitiveisolatesThr⁃86⁃IleVal⁃149⁃IleSer⁃203⁃AsnThr⁃206⁃AlaLys⁃285⁃ArgSer⁃203⁃AsnThr⁃206⁃AlaLys⁃285⁃ArgIsolatesNo．102628997162710Proportion/%1005．8813．5997．066．867．771009．80

3　讨　论

研究发现在临床和兽医药中的不规范使用是导致弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药率升高的最主要原因[7]。欧美等发达国家弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药率要低于发展中国家。美国耐环丙沙星弯曲菌在1990年开始出现，1997年开始呈现增加趋势[14]，2001-2002年美国腹泻病人粪便源弯曲菌环丙沙星的耐药率为13.5%，鸡来源环丙沙星耐药率为19%[15]。2011-2013年加拿大对腹泻病人源空肠弯曲菌的耐药率为30.8%，对结肠弯曲菌的耐药率是41%[16]。印度在上个世纪90年代开始出现耐氟喹诺酮类弯曲菌[17]，在1994年未有对氟喹诺酮类耐药弯曲菌的相关报道，2001-2006年升高到79%[17-18]2008-2010年高达到97%，耐药情况非常严重[19]。

我国空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药情况非常严重。1995-2010年腹泻病人来源的空肠弯曲菌对环丙沙星的耐药率为80.2%，对萘啶酸的耐药率为79.3%，且随着时间的推移，萘啶酸和环丙沙星的MIC有明显增高的趋势[20]。858株不同宿主来源的空、结肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药率接近95%[21]。2011年我国宁夏和山东两个地区猪来源的结肠弯曲菌对环丙沙星的耐药率高达95%以上[22]。最近研究表明，耐喹诺酮类弯曲菌在17年内增长迅速，在2000年就增长到93.7%-100%[23]。本研究中，234株空肠弯曲菌中共筛查到218株(93.16%)萘啶酸耐药菌株，211株(90.17%)环丙沙星耐药菌株，两者都是鸭粪和鸡粪来源菌株耐药率最高为100.00%，是和在家禽的养殖过程中萘啶酸和环丙沙星作为饲料添加剂用于预防和治疗细菌性疾病有关系。

空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药与gyrA基因上QRDR特异性点突变密切相关[24-26]，且最重要最常见的是gyrA基因发生的Thr-86-Ile突变[27-30]。本研究中所有的耐喹诺酮类空肠弯曲菌均有Thr-86-Ile突变，且1株菌只发生Thr-86-Ile突变，其萘啶酸的MIC可达到512 ug/mL，环丙沙星MIC达到32 ug/mL，说明Thr-86-Ile突变是导致空肠弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素的高水平耐药的主要原因。

与喹诺酮类敏感菌株相比，耐喹诺酮类空肠弯曲菌除Thr-86-Ile突变外，Val-149-Ile也是特异性突变，虽然Val-149-Ile突变已有报道，但并未描述该突变是否可导致空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素高水平耐药[29]。本研究中发生Val-149-Ile协同突变的菌株和未发生协同突变菌株相比，MIC值没有增高。本研究测序结果显示：菌株萘啶酸MIC值大于等于64 μg/mL，环丙沙星MIC值大于等于4 μg/mL时Thr-86-Ile已经发生突变；而菌株的萘啶酸MIC值大于64 μg/mL，环丙沙星MIC值为2 μg/mL时，也发生Thr-86-Ile突变，提示菌株gyrA基因发生Thr-86-Ile突变就可以导致萘啶酸和/或环丙沙星耐药。

本研究中，未发现耐药菌株存在gyrB基因的有义突变。研究结果与目前耐喹诺酮类空肠弯曲菌gyrB基因不存在有意义突变的报道一致[28]。

本研究通过对不同宿主来源空肠弯曲菌萘啶酸及环丙沙星的耐药现状及遗传特点分析，确定所有耐药菌株均存在gyrA基因QRDR的热点突变Thr-86-Ile，该突变能引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素产生高水平耐药。

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