全自动蛋白测定系统在饲料粗蛋白检测中的应用

袁艳茹

（安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南 安阳 455000）

蛋白质是生命的物质基础，是动物一切细胞、组织的重要成分，是生命活动的重要承担者。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与，而且蛋白质分解后可以给畜禽提供能量［1］。蛋白质在维持动物的免疫功能及表达免疫活性中发挥着特殊的生物学作用［2］。此外，蛋白质相关的血液指标（如血红蛋白、血清总蛋白、血清尿素氮）有所变化时，可能与畜禽的异食癖有关［3］。饲料中蛋白质的检测有很多种，例如，李博等［4］对饲料蛋白质的几种检测方法的原理、特点及应用进行了综合阐述，其中实验室比较常见是近红外光谱技术法和凯氏定氮法。近红外光谱分析技术具有快速的特点，但存在灵敏度差和建模困难等缺点［5］。粗蛋白是饲料检测的一个重要指标，凯氏定氮法是目前最常用的检测粗蛋白含量的方法。凯氏定氮法原理是饲料样品在催化剂（五水硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠）作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵，然后加入过量强碱进行蒸馏，使氮以氨气的形式逸出，用硼酸吸收逸出的氨，之后用甲基红溴甲酚绿为指示剂用强酸滴定硼酸铵，测出氮含量，将氮含量乘以蛋白转换系数（6.25），计算出粗蛋白的含量［6］。而全自动蛋白测定系统则是根据经典凯氏定氮法设计的全自动消解、全自动蒸馏、全自动滴定及出结果的半微量系统，该系统为饲料中粗蛋白检测提供了极大的便利，具有安全、准确、快速、操作简单等特点。全自动蛋白测定系统采用石墨消解仪消解样品，然后消解液放到全自动蛋白测定仪上固定，设好参数，蒸馏、定氮、滴定、出结果一气呵成，在保证准确度的前提下，整个定氮滴定出结果在10 min内即可完成。现针对全自动蛋白测定系统对粗蛋白的测定进行系统性研究。

1 称取饲料样品

样品称取量应考虑样品的含氮量，样品含氮量高，在尽量减少称量误差的前提下，应称取较少量的样品；如果样品的含氮量低，应称取较多的样品。全自动蛋白测定系统称取样品含氮量15～50 mg最为合适。表1为常见饲料及原料的适宜称样量。

称样时可用滤纸的1/4对折后称样，像包药粉一样，包装完好，不能有样品撒出来，之后把包好饲料包滑至消化管底部。同时做空白对照，即把1/4滤纸折好，直接滑至消化管底部。

2 饲料样品消化

表1 饲料及原料适宜称样量

样品消解前，每个消化管中放入一个消解片，消解片要滑到消解管的底部。消解片是由3.6 g硫酸钾和0.4 g五水硫酸铜混匀压制而成的。之后每个消化管中加入10 mL浓硫酸，之后把消化管连同消化管架一同放到石墨消解仪上，打开通风橱和减压排酸雾水管，盖上排酸架盖。消化仪上有20个孔位放置消化管，如果消化样品不足20个，带样品的消化管放置可按照排烟管路的走向放置，剩下孔位，可去掉消化管塑料盖或者放上加入10 mL浓硫酸的消化管，之后可按步骤消化。

仪器消化参数的设置需考虑样品是否起泡，如果样品起泡，可设置200℃消化0.5 h，之后400℃消化2.5 h；如果样品不起泡，直接设置400℃消化3 h。消解仪操作界面简单，界面仅有时间和温度参数，设置好这两个参数后，直接按确定键进行消解。仪器提示消化完成后，待消化管中雾基本消失时，可以关闭减压排酸雾水管，取出消化架，等消化液降温后可进行定氮蒸馏。

消解仪是石墨消解仪，石墨消解仪具有消解快速、高效、操作方便等特点，特别适合与凯氏定氮仪配合使用。此外，石墨消解仪炉内温度连续可调，温度恒定，可同时消解20个样品，炉内平均温差小，样品消解一致性好，热传导效率高。石墨经过抗氧化处理，消解仪表面耐强酸强碱腐蚀，样品各部受热均匀，炉体孔间温差小，可以快速、高效地消解样品。

3 饲料样品全自动定氮、滴定

3.1 试剂的准备

在滴定之前要准备的试剂为标定过0.1 mol/L盐酸标准滴定液，400 g/L氢氧化钠溶液，2%硼酸溶液，0.1%甲基红乙醇溶液，0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，混合指示剂（甲基红指示剂和溴甲酚绿指示剂以1∶5混合均匀）。其中，混合指示剂和2%硼酸溶液以1∶100混合均匀装入硼酸桶；400 g/L氢氧化钠溶液装入碱桶；蒸馏水加入水桶，标定过滴定酸加入滴定酸桶。

3.2 全自动定氮、滴定过程

先准备3根空的消解管，打开全自动定氮仪开关，打开冷却水开关，下面分四步进行。第一步，进行换算清洗。换算清洗要进行三四次，这个过程可以排掉滴定酸管路的气泡，相当于润洗滴定酸管路。第二步，把第一个空的消解管放到定氮仪上固定，之后按仪器上测试键，输入相应滴定酸浓度，硼酸体积15 mL，稀释水10 mL，碱5 mL，蒸馏5 min，设置好后按确定键，全自动定氮滴定开始。第一管也被称为空蒸，以使各个管路充满液体，也是对蒸馏管路进行预热。接着第二三个空管按上面参数进行定氮滴定，所用滴定酸体积应小于0.05 mL，主要是看换算清洗是否彻底。此外，第二三个管各自所用滴定酸体积一般小于0.1 mL，这主要体现定氮滴定系统空体积。第三步，准备2个称取0.1 g左右干燥过的基准硫酸铵于消化管，样品质量输入实际称取硫酸铵的质量，空体积为第二步第二个管和第三个管所用滴定酸体积的平均值，碱体积改为10 mL，其他参数和第二步一样，按确定键开始定氮滴定，2个硫酸铵管都进行完后，查看含氮量是否为21.19%±0.2%。如果是，可以做样品；如果不是，可以检查仪器的各个管路，如果仪器管路没有问题，硫酸铵含氮量比较稳定，可以考虑做定标系数来校准仪器的系统误差。第四步，做样品。样品质量按实际称取量填写，空白样品质量不需填写，碱参数改为50 mL，蛋白系数为6.25，其他参数同第一步。先做2个空白样品，做完后2个管所用酸的体积的平均值作为样品的空白体积。然后填入参数，即可做样品。做完样品后滴定酸体积、粗蛋白含量、氮含量便可显示出来，如果需要打印直接按打印键。测定结果2个平行样之间的精密度用相对偏差进行记录，偏差要求为CB/T 6432—94的组蛋白偏差要求。

仪器设置好各个参数，按确定键仪器开始自动进行所有步骤。试验步骤为加稀释水、加硼酸、加碱、蒸馏、滴定、计算、打印和接受杯清洗（主要在于设置参数里是否选定该项，选定则有这个步骤）。在测试过程中全自动定氮滴定系统实时采集仪器多方面状态信息：蒸汽发生器的水位，安全门在位，冷凝水有无等。如果有异常，仪器会暂停任务。全自动系统实时显示当前操作项目及实时量，当前功能完成后自动转移至下一试验功能。此外，试验过程中随时可以暂停试验。试验过程中如果某个参数为0，试验过程不开启此项功能。

3.3 定标系数K

仪器测定样品时，由于各系统连接会有系统误差，为了测定结果的精确，建立偏差校正系数K。

校准时可选用干燥基准硫酸铵，直接精密称取0.1 g左右硫酸铵于消解管中，固定在全自动定氮仪消化管位置，参数同3.2中硫酸铵测定参数相同，直接读取结果中的含氮量。

K值的计算为K=N/N1。其中，N1为标准样品中氮的百分含量，一般为硫酸铵理论氮的百分含量乘以其纯度；N为仪器测出的标准样品中氮的百分含量。

一般准备硫酸铵固定样品3份，上机测定，得到3个氮的百分含量，同时得到3个K的值，3个K值平均值就是定标系数K。把定标系数填到仪器设置下定标系数，再测几个硫酸铵固体样品，使得含氮量在21.19%±0.2%。

4 结语

全自动蛋白测定系统具有准确、快速、安全、操作简便的特点，本文对全自动蛋白测定系统测定饲料中粗蛋白的方法进行了探究，希望有助于该系统得到广泛应用。

［1］蛋白质饲料对畜禽的营养作用［J］.甘肃畜牧兽医，2017（2）：104.

［2］董佳绮，金三俊，汪晶晶，等.蛋白质营养水平对畜禽免疫作用的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2017（9）：80-82.

［3］李志静，周玉香.日粮蛋白质对畜禽异食癖以及消化代谢和生理功能的影响［J］.饲料研究，2013（11）：40-43.

［4］李博，杨卫军，张珍珍.饲料中蛋白质检测方法的研究进展［J］.畜牧与饲料科学，2017（6）：38-40.

［5］赵雅新，王红英.近红外光谱技术在饲料工业中的应用进展［J］.饲料工业，2005（21）：37-41.

［6］国家技术监督局.饲料中粗蛋白测定方法：GB/T 6432—94［S］.北京：中国标准出版社，1994.