根瘤菌、超声和2,4-D处理对小麦幼苗生长的影响

田华阳,戴云驰,张 鑫,杨艳琳,封德顺

山东农业大学 农学院,泰安 山东 271000

根瘤菌对双子叶植物生长的促进作用的研究成果颇丰，而许多重要的粮食作物为单子叶植物，如何将根瘤菌利用在单子叶植物上是一个非常有意义的问题，诸多研究人员在这方面做了大量的探索。提升粮食作物的种子活力对于农业生产有重要的意义，一些物理方法如超声波处理可以提高绿豆和掌叶大黄种子的发芽率[1,2]，通过超声波和赤霉素结合处理川西獐牙菜种子可以提高种子萌发能力[3]，说明通过多种因素共同处理植物种子可以影响种子活力及植物的发育。

植物生长状况优良与否很大程度上依赖于根系对土壤养分和水分的吸收能力。土壤中的养分需要经过根系的吸收转化才能进入植物体内，为植物所利用，而植物吸收营养元素能力的强弱很大程度上取决于根系构型。如何改变植物根系构型，或间接增加其生物产量成为促进植物生长的有效手段。超声处理对水稻对其延展根系或提高其营养器官质量等具有显著促进作用[4,5]。超声处理小麦种子可以提高其萌发率[6,7]。根瘤菌在禾本科植物中的定殖和促进作用[8]，以及水稻内生菌的发现[9]，促进了非豆科植物固氮的研究[10-14]。产量的增加、固氮机理和微生物与植物共同作用等方面的研究的进一步的深入，使人们提高了对植物与微生物的相互协调生态圈的认知。本研究利用超声和根瘤菌单独或组合处理小麦种子，以及根瘤菌和2,4-D单独或组合处理小麦幼苗，探讨不同因素对小麦幼苗的促进作用，以期为小麦种子处理提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山融3号（由山东大学夏光敏教授实验室提供）；根瘤菌剂（购买于克劳沃公司）。

1.2 试验设计及测定指标

1.2.1 超声和根瘤菌处理吸胀种子 取饱满的山融3号小麦种子200粒，进行种子表面消毒，暗处萌发至胚根刚刚突出，然后取状态一致的种子进行超声和根瘤菌处理试验。设4个处理，每个处理10粒种子，共三次重复。分别为处理1（100 W超声处理种子15 min）；处理2（0.025 g/mL根瘤菌液浸泡种子60 min）；处理3（100 W超声处理15 min后又用0.025 g/mL；根瘤菌液浸泡种子60 min）；用不加处理的种子作对照，标记为CK1；然后置于玻璃瓶（锡箔纸包裹）的吊篮中水培，14 d后测量根长。

1.2.2 根瘤菌与2,4-D处理小麦幼苗 取饱满山融3号小麦种子200粒，进行种子表面消毒，暗处理萌发48 h，挑选萌发效果较好种子，播种于土培小盆营养体中，每盆播种9粒种子，均匀排布，设4个处理，每个处理3次重复，处理之前均使用等量自来水为植株生长提供所需水分，每2 d浇1次水，2周后作实验处理。实验处理分别为：处理4（用250 mL含终浓度为0.05 mg/L 2,4-D的1/2MS营养液处理）；处理5（用250 mL含有0.05 g根瘤菌的1/2MS营养液处理）；处理6（用0.05 mg/L2,4-D和0.05 g根瘤菌的复合物的1/2MS营养液250 mL处理），使用1/2MS营养液处理的小麦作为对照CK2，第1次处理3 d后进行第2次处理，处理2次，每次处理有效周期为3 d，之后每次与CK2处理一致，均只浇营养液250 mL，每3 d 1次，45 d后测定小麦鲜重和叶绿素含量。

1.2.3 测定指标

1.2.3 .1根长 根长测量使用直接测量法，每株重复3次。

1.2.3 .2植株鲜重 植株鲜重分为苗重、根重和总重，洗净晾干后直接称重，每株重复3次。

1.2.3 .3叶绿素 参考崔勤等[15]方法进行改进，使用液氮进行研磨提取并测定，同株幼苗重复3次。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准差表示。各处理组与对照组之间的测量值差异采用t检验。当P＜0.05时认为差异显著，当P＜0.01时认为差异极显著。

2 结果分析

2.1 超声处理与菌液共同作用下对小麦根长的影响

由图1可知，与CK1相比处理1和3分别有显著和极显著性差异，说明处理对小麦幼苗的根长有显著的促进作用；处理1、处理2和处理3较CK1分别提高了15.5%、6.1%和20%。而处理1与处理3相比，说明根瘤菌液在对超声处理后的种子中有着促进其生长发育的作用；处理1与处理3对比表明，仅进行100 W超声处理对小麦根长的影响效应较之超声和根瘤菌共同作用有所下降，在三种处理中，处理3对于小麦幼苗根长的促进作用极显著。超声的单独处理或者与根瘤菌液的共同处理显著促进了处理组的根的发育。

图1 超声和根瘤菌处理下的小麦根系长度Fig.1 The root length of wheat treated by ultrasound and rhizobium

2.2 根瘤菌与激素共同作用下的小麦生物量

2.2.1 根瘤菌与激素对于小麦幼苗鲜重的影响

表1 不同处理下小麦不同部位的鲜重Table 1 Fresh weight of different parts of wheat under different treatments

由表1中可知处理5与处理6对于小麦鲜重有显著促进作用，而处理4没有显著促进作用；处理5与处理6相比较而言，激素与根瘤菌制剂共同作用对于小麦幼苗的生物量有更加显著的促进作用。根瘤菌对于小麦幼苗鲜重的促进作用在与激素结合处理后得到更显著的提升，数据表明激素与根瘤菌制剂共同作用的结果极显著。

2.2.2 根瘤菌与激素对于小麦幼苗叶绿素的影响 由图2、3可知处理4、5、6均可提高小麦幼苗的叶绿素含量，无论是叶绿素a还是叶绿素b的浓度都在一定程度上得到提高，对应的总浓度也在提升，处理5和处理6效果尤为显著，其叶绿素总浓度分别提升了51.00%和78.95%。同时处理6的叶绿素a与叶绿素b的比值相对对照有所下降。处理因素提高了处理对象的叶绿素浓度，使得在相同大小叶组织中，处理组含有更多的叶绿素。图4显示，处理4、5和6的小麦的叶片比对照颜色深。

图2 不同处理方式下小麦叶中叶绿素a、b浓度比较Fig.2 Comparison of chlorophyll a b concentration in wheat leaves under different treatments

图3 不同处理方式下小麦叶中叶绿素总浓度比较Fig.3 Comparison of total chlorophyll concentration in wheat leaves under different treatments

图4 根瘤菌与2,4-D处理的小麦表型Fig.4 Wheat phenotype treated with rhizobium and 2,4-d treatments

3 结论与讨论

超声处理、超声与根瘤菌液复合处理萌动48 h的小麦种子可以促进幼苗根长显著增长；根瘤菌液处理、2,4-D与根瘤菌液共同处理的小麦幼苗的生物量等指标显著提高，2,4-D与根瘤菌液共同处理的幼苗鲜重和叶绿素含量效果极显著。可能是由于伤口的产生引起了植物酮类物质的分泌，从而诱导根瘤菌进驻植株，超声产生的细微伤口或可引导根瘤菌在浸泡处理萌发种子时进驻种子内部定殖，后期产生促生作用。相对于前期人们对于单因素超声或者根瘤菌对小麦等单子叶植物的促生作用而言，实验结果表明了复合处理的显著优势，2,4-D激素与根瘤菌液处理虽未显现出根部结瘤的现象，但处理对于生物量的增加效果不可忽视。

前人发现对干种子或湿种子进行超声处理，可以明显诱导和促进植物细胞的分裂，促进细胞生长[16]，促进水稻根系的伸展[5]；微细按摩作用对于提高细胞壁和细胞膜的穿透性的一系列功能变化，有利于内外物质的交换和运输、提高新陈代谢的速率和酶活等[17]。超声处理或可刺激胚根尖端，诱导植物产生生长所必需的激素和氨基酸，分解胚部有机大分子[20]。从而激活或阻断某种基因的表达，调控酶的诱导和阻遏，与超声协同作用刺激根部伸长，改善其根系构型，利于根系下扎，从而增加其对营养的吸收能力，提高肥料的利用效率[18]。本研究通过超声处理和根瘤菌液浸泡的手段证明了超声处理在一定程度上可以促进小麦根系发育，同时说明了根瘤菌可能通过超声产生的细微伤口进入种子内部，从而对种子的活力或植株各生育阶段的发育提供可能的帮助。

研究表明，从紫云英中分离的根瘤菌可以再水稻根部定殖并促进水稻的生长[19,20]。利用田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦种子进行侵染，可以在小麦根系内定殖并对小麦有促生作用[21]。本研究中也发现根瘤菌剂可以提高小麦的根和植株的鲜重。根际微生物可利用根系分泌的无机盐和一些生理活性物质[22-24]，还可以通过mi RNA调节靶基因蛋白来调控根系的构成和营养生长过程[25]。吲哚乙酸作为跨界信号分子调控微生物与植物之间的关系[26-28]，我们推测，其同类物质2,4-D可达到同样的效果，作为信号分子，成为植物与微生物沟通的桥梁，诱使根瘤菌黏附于植物根系分泌物上或根系黏液层外壳，进而进行代谢生长或调节其生理过程，刺激植物生长，为研发新型肥料提供可能的渠道。

无论是种子处理还是后期幼苗处理，结果都是为了能够获得植株较大生物量的增加。根瘤菌、激素和超声的处理在根系扩展和植株幼苗的生长过程中有着显著作用，但这三种因素的复合处理促进小麦幼苗生长的机理有待于进一步研究。

[1]白钧元.超声辐射对植物种子细胞膜渗透性的研究[D].西安：陕西师范大学,2014

[2]周 浓,胡廷章,肖国生,等.超声波处理对掌叶大黄种子萌发特性的影响[J].西南农业学报,2012,25(6)：2279-2283

[3]张卫华,董汇泽.超声波和赤霉素对川西獐牙菜种子萌发能力的影响[J].植物生理学通讯,2009(7)：727-728

[4]赵忠良,张连萍,张 蓓,等.超声波处理稻种对其生根发芽的影响[J].农机化研究,2011(6)：122-124

[5]聂俊,肖立中,严卓晟,等.籼稻干种子经超声波和包衣处理后的发芽和根系生长变化[J].华北农学报,2014,29(2)：181-187

[6]李 刚,王乃亮,罗娘娇,等.超声波处理对当归种子萌发及活力的影响[J].西北师范大学学报,2007,43(3)：75-77

[7]乔安海,张建生.超声对种子萌发和产量的影响[J].安徽农业科学,2009,37(20)：9438-9439

[8]杜寒春.根瘤菌对禾本科作物生长的促进作用研究[D].南京：南京农业大学,2005

[9]李龚程,张仕颖,肖 炜,等.水稻中内生菌研究进展[J].中国农学通报,2015,31(12)：157-162

[10]刘庆城,许玉兰,张玉洁.2,4-D诱发小麦根部结瘤效应的研究[J].中国农业科学,1990,23(6)：19-26

[11]何新华,陈力耕,陈怡.非豆科木本植物与放线菌共生固氮相关基因研究进展[J].浙江林学院学报,2004,21(1)：110-114

[12]李 婷,何 来,梁泉峰.非豆科植物的根瘤菌促生机制的研究进展[J].中国农业科技导报,2013,15(2)：97-102

[13]迟 峰.根瘤菌在植物内的迁移运动及其与植物相共同作用用的蛋白质组学研究[D].北京：中国科学院研究生院（植物研究所）,2006

[14]马贵兴,井申荣.固氮分子机理及固氮基因转移研究进展[J].生命科学,2013,25(1)：113-116

[15]崔 勤,李新丽,翟淑芝.小麦叶片叶绿素含量测定的分光光度计法[J].安徽农业科学,2006,34(10)：2063

[16]袁畹兰,张福成,郭孝武.低频脉冲超声对小麦育种效应的初步研究[J].陕西师大学报,1983(1)：34-46

[17]赵艳军,王宝军,刘 婧,等.超声对小麦种子萌发特性的生物学效应研究[J].种子,2012,31(9)：112-114

[18]占 爱.提高养分、水分吸收的根系形态和生理调控[D].西安：西北农林科技大学,2015

[19]张晓霞,王 平,冯新梅,等.对水稻有促生作用的紫云英根瘤菌筛选初报[J].土壤肥料,2001(6)：30-45

[20]张晓霞,王 平,冯新梅,等.外源基因标记的紫云英根瘤菌在水稻根部的定殖研究[J].生态学报,2003,23(4)：771-776

[21]刘华伟,孙 超,杨 呼,等.田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦种子侵染的促生作用及其在根系内的定殖[J].植物营养与肥料学报,2012,18(1)：210-217

[22]孟颂东,关桂兰,王卫平,等.根际微生物产生的植物激素对小麦生长的作用[J].植物生理学通讯,1998,34(6)：427-429

[23]陈伟立,李 娟,朱红慧,等.根际微生物调控植物根系构型研究进展[J].生态学报,2016,36(17)：5285-5297

[24]吴林坤,林向民,林文雄.根系分泌物介导下植物-土壤-微生物共同作用关系研究进展与展望[J].植物生态学报,2014,38(3)：289-310

[25]陈永超,齐怀廷,王小晶,等.田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶组织的促生作用研究[J].西北植物学报,2016,36(7)：1383-1390

[26]杨 扬,高克祥,吴 岩,等.吲哚乙酸跨界信号调节植物与细菌共同作用[J].生物技术通报,2016,32(8)：14-21

[27]Malhotra M,Srivastava S.An ipd Cgene knock-out of Azospirillum brasilense strain SM and its implications on indole-3-acetic acid biosynthesis and plant growth promotion[J].Antonie van Leeuwenhoek,2008,93(4)：425-433

[28]连 宾,王进军,陆 玲.植物与微生物的化感作用[J].南京师大学报：自然科学版,2007,30(1)：88-95