LncRNAs在口腔鳞癌中的作用及机制研究进展

邵苗苗，许 诺，刘钟西，柳清华，王 栋，胡书海，李晓杰

(1.大连医科大学 口腔医学院，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学中山学院，辽宁 大连 116000)

LncRNAs可定义为长度>200 nt，无蛋白质编码能力的转录物[1]。LncRNAs在干细胞生物学，发育，分化等多种生物学过程中发挥重要作用，几乎与基因表达的所有步骤都有关联，包括基因转录，前mRNA剪接，RNA衰变和翻译。这些程序中的任何一环出现问题都会导致多种疾病的发生。体内外的研究已证实，lncRNAs的表达与癌症的进展关系密切。LncRNAs在特定的癌症类型中存在差异表达，运用不同的机制执行细胞学功能。因此，lncRNAs是当前癌症研究的焦点，lncRNAs的功能分析是一个新兴的研究领域。在临床应用方面，了解lncRNAs的功能为我们理解不同癌症的生物学行为和确定新的治疗靶向奠定了基础，其中包括口腔鳞状细胞癌。

口腔鳞状细胞癌 (oral squamous cell carcinoma，OSCC) 是东南亚地区最常见的恶性肿瘤。在我国，OSCC的发病率约在3.6/10～8.0/10万人。在美国，OSCC在每年的致死癌症中排第八位。OSCC具有很强的侵袭性，常致病人的形态丧失和功能失调，高达60%的OSCC患者在就诊时已处于临床进展的晚期阶段(Ⅲ期，Ⅳ期),OSCC的五年生存率仅为10%～50%[2],因此如何早期检测和确诊OSCC，实现靶向治疗是目前研究的热点。OSCC的发生发展是由基因组和表观基因组的改变共同调控的。但是，相关的机制仍有待阐明。越来越多的证据表明，lncRNAs的表达失调可能会影响多种癌症的进展，主要是在表观遗传，转录和转录后多个水平上诱导和促进癌症的进展，包括口腔癌。因此,lncRNAs有望成为可靠的生物学标志物和抗肿瘤治疗的靶点，本文着重对lncRNAs在OSCC中的作用和机制进行综述，探讨其作为诊断依据，治疗靶向和预后指标等潜在的临床应用，为口腔癌患者提供新的治疗策略。

1 长链非编码RNAs的概念和功能机制

在人类基因组中，能编码蛋白质的基因占总基因的2%左右，其他不编码蛋白质的序列中，90%以上被转录成RNA，这些不具有蛋白质编码功能的RNA分子统称为非编码RNA(non-coding RNAs)。根据其分子大小，分为两组。长度<200个核苷酸的RNA分子叫做短链非编码RNAs，如小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs),PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNAs ，piRNAs)和微小RNA(microRNAs，miRNAs)。近年来，大部分肿瘤的研究都集中在miRNAs；另一组长度>200个核苷酸的RNA分子叫长链非编码RNA(lncRNAs)，多数由RNA聚合酶Ⅱ转录形成，少数由RNA聚合酶Ⅲ转录形成，存在于核内或细胞浆内[3]。LncRNAs根据其与对应mRNA的关系通常被分成五种类型：正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(antisense lncRNA)、双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、基因内lncRNA(intronic lncRNA)、基因间lncRNA(intergenic lncRNA)[4]。LncRNAs曾一度被认为是基因组转录产物的噪音，但是近年来， lncRNAs受到的关注越来越多，一些lncRNAs在肿瘤中的作用机制被阐明，依据研究结果制定的靶向措施也对体内外的恶性细胞起到一定抑制作用，尽管具体角色还有待进一步挖掘，但是可以证实一些lncRNAs可以通过一定的分子机制在多种细胞过程中扮演重要角色，例如细胞生长、分化、凋亡，新陈代谢，肿瘤发生阶段等过程。根据已经研究的lncRNAs，得知lncRNAs调控基因表达的作用机制主要有两种类型：转录调控和转录后调控,前者可通过改变染色质结构和直接调节转录因子活性来调节基因的表达,后者通过调节mRNA的形成及其翻译达到对基因转录后的调控[5]。

目前的研究表明，lncRNA主要有以下5种功能[6]：(1)由上游非编码启动子转录的lncRNA可通过抑制RNA聚合酶II募集和/或诱导染色质重构促进或抑制下游基因的表达；(2)反义转录本来源的lncRNA能够与前mRNA杂交并干扰剪接体对剪接位点的识别，从而产生不同的剪接转录物。同样，正义和反义转录物的杂交可以由Dicer酶作用产生内源性siRNAs；(3)lncRNA与miRNA的结合可以导致miRNA的功能沉默； (4)lncRNA与特定蛋白质复合物结合可以调节蛋白质的活性，参与细胞的结构和组织功能，改变蛋白质在细胞中的定位，并影响表观遗传调控过程； (5)lncRNAs可以加工成小RNAs。总之，lncRNAs可以在转录水平，转录后水平，表观遗传水平等多个方面发挥作用，调控基因的表达，进而参与机体生长，发育，遗传，代谢，衰老和死亡等重要的生命活动以及影响疾病的发生发展。

2 LncRNAs在口腔鳞癌中的作用和机制

2.1 MALAT 1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)

MALAT1是在研究与早期非小细胞肺癌(NSCLC)相关转录本的过程中被鉴定出,也是一种与癌症转移密切相关的lncRNA，在多种肿瘤类型中均高度表达，主要存在核散斑中[7]，被认为与病人不良愈后和高转移潜能有紧密关联。MALAT1是一种高度保守的lncRNA，位于染色体6p24.3上，长8.7 kb[8]。多个启动子在MALAT1转录中发挥作用并产生不同的MALAT-1转录变异型。 MALAT1因其三螺旋结构而具有独特稳定，因其在核斑点中的定位在RNA代谢中扮演着重要角色。有报道显示MALAT1在癌组织中的表达是上调的并能调节细胞周期基因的表达，由于可以调控致癌转录因子B-MYB(mybl2)，MALAT1在G1/S和有丝分裂过程中也必不可少。 MALAT1能调节生长控制基因和对一些基因进行转录后调节，如RNPS1，PRP6和SON，已有报道可通过MALAT1的选择性剪接而实现[9]。总之，这些研究强调MALAT1无论在转录和转录后水平上都对基因的表达具有一定的调控作用。通过RNA的干扰分子(RNAi)敲除OSCC细胞中的UCA1,MALAT1,HOTAIR,和FOXCUT后发现能减慢体内外肿瘤的发展速度，具体表现为抑制细胞增殖，促进凋亡，抑制OSCC细胞的侵袭和转移。最近Zhou等[10]发现与正常口腔黏膜相比，MALAT1在OSCC组织中存在过表达。Liang等[11]采用qPCR的方法发现，MALAT1在TSCC组织比正常组织中表达量高，且与颈部淋巴结转移有关。在OSCC细胞系(TSCCA和Tca8113)中通过小干扰RNA敲低MALAT1的表达可描述其在维持上皮 - 间质转化(EMT)，介导细胞迁移和侵袭方面发挥的作用。在机制上，敲低MALAT1表达能显著抑制N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达，但在体外实验中可诱导E-钙粘蛋白的表达。总之，这些发现为我们深入了解MALAT1在调控OSCC转移中的作用及机制提供更好的平台，表明MALAT1是一个重要的预后因素和治疗OSCC的靶向目标。

2.2 MEG3(maternally expressed gene 3)

MEG3是第一个被发现具有肿瘤抑制特性的lncRNA。 MEG3在很多正常人体组织中有表达，而在许多癌症和肿瘤细胞系中表达丧失。肿瘤中MEG3表达丧失可能源于某种基因的缺失，启动子超甲基化或基因间差异表达的甲基化区域发生超甲基化[12]。机制研究表明，MEG3的重新表达能抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤集落的形成，即 MEG3与肿瘤发生呈负相关。MEG3能降低鼠双微小体2同系物(MDM2)表达，导致p53的积累，抑制神经胶质瘤细胞的生长并诱导p53依赖性和非依赖性形式的细胞凋亡。而且，MEG3的表达在人脑胶质瘤和脑膜瘤组织中显著降低[13]。

与周围的非恶性组织比较，lncRNA MEG3的表达在舌鳞状细胞癌中均显著降低，可提示OSCC患者的预后不佳[14]。从影响细胞功能方面而言，MEG3在SCC-15和CAL27细胞中的过表达能抑制细胞增殖和细胞周期进程并触发细胞凋亡。而且，在宫颈癌中HPV诱导的MEG3下调已被认为是有重要意义的肿瘤发生机制且它可能在HPV相关的OSCC中发挥一定作用[15]。这些结果强调了MEG3可作为一种癌症抑制性的lncRNA，特别是在HPV相关的OSCC中。2017年的一项研究发现MEG3在OSCC中的表达明显下降，且CAL27细胞中过表达的MEG3能抑制癌细胞的增殖和转移，促进细胞的凋亡。重要的，MEG3能通过抑制WNT/β-细胞因子连环蛋白轴通路起到肿瘤抑制剂的作用。这些研究表明，调节MEG3有望成为治疗OSCC的靶向目标[16]。

2.3 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)

HOTAIR是研究最多的一个典型的反义lncRNA，也是第一个被发现与肿瘤密切相关的 lncRNA,其在乳腺癌，胰腺癌，大肠癌，肝癌，食管鳞状细胞癌中都有高表达[17]。它有两个主要功能区域[18]：位于RNA 5’端的PRC2结合结构域(polycomb repressive complexes 2,PRC2)和位于3’端的LSD1/CoREST1结合域(lysine specific demethylase 1 complexes， LSD1 )[19]。HOTAIR相当于一个分子支架，在HOXD位点上与组蛋白修饰PRC2复合物和赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)/CoREST/REST复合物结合，导致偶联的组蛋白H3K27三甲基化和H3K4去甲基化。当HOTAIR过度表达时，PRC2和LSD1增加染色质占据新的靶点和抑制许多抗转移基因的转录，导致癌症转移。重要的是，HOTAIR在多种器官来源的癌组织中存在过度表达的现象，包括胰腺，乳房，结肠和胃肠，且HOTAIR的过度表达与肿瘤转移和预后不良有密切关联。据有关研究证明HOTAIR是在癌组织中有上调的现象，特别是在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中[20]。Wu等[21]在2015年利用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)的方法分析lncRNA HOTAIR在OSCC组织中及正常组织中的表达，结果表明：与正常组织相比，HOTAIR在OSCC中表达量升高；与无淋巴结转移的肿瘤相比，HOTAIR在发生局部转移的组织中表达量升高。单变量分析显示HOTAIR表达水平与OSCC 的临床阶段、淋巴结转移，肿瘤分期和分化程度联系密切，HOTAIR高表达的患者愈后较差。进一步实验发现，在体外通过siRNA敲低HOTAIR后，OSCC细胞的增殖和克隆形成受到抑制，OSCC细胞侵袭和转移能力增强。HOTAIR水平与E-钙黏着蛋白水平呈明显负相关，通过将PRC2复合体单元EZH2和组蛋白 H3K27me3与E-钙黏着蛋白促进子结合来调控E-钙黏着蛋白的表达，因而推测lncRNA HOTAIR的表达与OSCC的发生发展和转移有密切关系，可能成为预测OSCC生存率的重要标志物。Lu等[22]报道HOTAIR在肿瘤组织中有表达上调的现场，特别是在转移的组织中，同样，在转移性OSCC细胞系中也能观察到一致的现象。在异种移植模型中，沉默口腔癌干细胞(OCSC)中HOTAIR的表达能显著抑制其干细胞的特性，侵袭性和肿瘤的发生发展。相反，OSCC中HOTAIR的高表达能增强其转移潜能和上皮-间充质转化(EMT)特性。总之，已有的数据表明，HOTAIR可以通过调控EMT过程协调癌细胞的干性和转移能力，因此HOTAIR可能成为OSCC的治疗靶点。

2.4 CCAT1(colon cancerassociated transcript1)

结肠癌相关转录物-1(CCAT1)，也被称为癌相关区域长链非编码RNA-5(CARLo-5)或CCAT1-S，具有2628个核苷酸的长度，定位于染色体8q24.21上。通过siRNA敲低CCAT1的表达会诱导G1期细胞停滞和增殖抑制。沉默CCAT1的表达会引起E-钙粘蛋白的上调并随后下调纤连蛋白和波形蛋白，这是EMT发生的关键标志[23]。最近的一项研究报道，CCAT1在27%(16/60)的口腔肿瘤中存在过表达。过度表达CCAT1的肿瘤显示高水平的c-Myc并能显著下调miRNA-155-5p和let7b-5p的水平。 更为重要的是，CCAT1水平高表达的患者显示出不良的治疗效果。CCAT1扩增的样本主要存在于具有侵袭性表型的肿瘤中且CCAT1表达升高的肿瘤患者中都具有吸烟史。这些结果表明，CCAT1可作为内源性海绵结构导致治疗效果不佳。

2.5 FOXC1(fork head box C1 upstream transcript)

FOXC1基因在多种恶性肿瘤中存在高表达，且与肿瘤的发生进展有功能上的相关性。最近研究表明：许多lncRNA能与相邻的编码基因形成一种功能性的lncRNA-mRNA组合共同发挥作用。研究人员发现FOXC1上游的转录本(FOXCUT)以及相邻的FOXC1基因在23例OSCC患者中表达显著上调，且两者表达水平呈正相关，即通过siRNA下调FOXCUT的表达时，FOXC1的表达也下降，在OSCC细胞中Tca8113和SCC-9中，FOXC1或FOXCUT的表达下调都能在体外抑制细胞增殖和转移，且MMP2,MMP7,MMP9的表达也下降。这些证据表明FOXC1与FOXCUT在lncRNA-mRNA组合高表达的OSCC患者中有一定的研究价值，可能作为一种新型的生物标志物和治疗的靶点发挥作用[24]。

2.6 TUG1

LncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)在口腔鳞状细胞癌中也有重要作用。实时荧光定量PCR结果显示在OSCC组织和细胞系中，TUG1表达上调。高表达的TUG1与肿瘤的TNM分期、OSCC患者的淋巴结转移和肿瘤分级显著相关。CCK-8法、MTT法、克隆形成实验、细胞侵袭实验通过转染siRNA敲除TUG1后抑制细胞的生长和细胞增殖，侵袭。在Tca8113及TSCCA转染TUG1 siRNA能诱导细胞凋亡。总之，敲除TUG1能抑制禁止细胞生长、增殖和侵袭，且通过靶向Wnt /β-catenin信号通路诱导OSCC细胞的凋亡。现有的数据表明，敲除TUG1可能作为一种治疗口腔鳞癌的新型靶点[25]。

2.7 LincRNA-ROR (long intronic noncoding RNA ROR)

Linc-ROR是位于18q21.31上，长度为2.6 kb的 lncRNA，由丰富的反转录转座子元件元素组成，如LINE，SINE和LTR等。LincRNA作为竞争性内源性RNA发挥作用，并通过在转录水平上扩增miRNA-145从根本上影响人胚胎干细胞的分化[26]。与linc-ROR相关的转录因子在多种肿瘤中存在表达，并与未分化的表型相关。长的非编码RNA的表达谱揭示linc-RoR可作为口腔癌预后的生物标志物[27]。Linc-ROR是一种程序重编的调控者，与肿瘤发生有关，在未分化的肿瘤中过度表达且与肿瘤复发和治疗效果不良有密切关系。通过其对miRNA-145-5p的海绵效应，linc-ROR能对其靶基因c-Myc，Kl，Sox2和Oct4进行转录后控制，这有助于形成和维持未分化状态。这项研究表明Linc-ROR的过表达与未分化的口腔肿瘤有关且监测Linc-ROR对临床治疗效果有一定的预测意义。

2.8 LncRNA AC132217.4

越来越多的证据表明，为了发生转移，癌细胞必须经常改变其lncRNA表达谱以调节许多生物过程[28]，例如通过EMT或是由TGFb信号诱导的各种信号传导途径[29]。在OSCC中，已有少数lncRNAs被报道参与细胞转移，为了鉴定影响OSCC细胞转移的新型lncRNA，Li X等[30]人通过尾静脉注射裸鼠建立了高转移性细胞系UMSCC6H。通过实验我们发现， LncRNA AC132217.4在UM-SCC6H细胞中增加并可以促进细胞迁移和EMT。LncRNAs在染色质组织中，转录或转录后水平上都能调节基因的表达。 AC132217.4通过在转录后水平上增强其mRNA的稳定性来促进IGF2的表达。研究数据表明，AC132217.4与IGF2 mRNA的30UTR结合，抑制其转换，并且它可以直接结合IGF2 mRNA的3′UTR并增加其稳定性，导致IGF2的水平增加。此后，我们发现KLF8与AC132217.4的上游序列可以发生结合，进而在转录水平上激活其表达，其通过AC132217.4-IGF2轴在体外和体内加速OSCC的转移。因此，上述数据表明KLF8-AC132217.4-IGF2信号通路在OSCC转移中起关键作用。

2.9 口腔鳞癌中的其他lncRNAs

PDIA3P1是一种大小为2099 bp的lncRNA，位于染色体1q21.1处。Zhang等[31]已经报道PDIA3P1在OSCC中存在过表达，但是PDIA3P 的表达水平与OSCC之间的关系并没有阐述。Sun等[32]在2017年对PDIA3P1的作用机制进行更深一步研究。qRT-PCR的结果显示，PDIA3P1在OSCC中存在高表达并能降低OSCC患者的生存率。CCK-8和克隆集落形成实验被用来检测PDIA3P的表达对细胞增殖的影响。通过转染siRNA沉默PDIA3P的表达可以抑制OSCC细胞的增殖，抑制肿瘤生长，减少增殖抗原Ki-67在体内的表达，负向调控miR-185-5p在OSCC细胞中的表达。因此PDIA3P可以作为OSCC治疗的靶向目标。Guo Y等[33]在2017年发现，lncRNA CEBPA-AS1与口腔鳞癌的不良预后有关联，且能通过CEBPA / Bcl2信号通路促进癌症的发生。CEBPA-AS1定位于细胞质与核周围的区域，可充当OSCC中表达上调的潜在致癌基因，与肿瘤的低分化，淋巴结转移及高临床分期有关，被认为是口腔鳞癌患者预后的重要生物标志物。沉默其表达能抑制OSCC细胞增殖，诱导细胞凋亡，迁移和侵袭，这一作用效果是由靶向CEBPA和通过CEBPA / Bcl2通路实现的。通过实时荧光定量PCR结果显示，lncRNA ferritin heavy chain 1 pseudogene 3(FTH1P3) 在口腔鳞状细胞癌中的表达上调，可以降低口腔鳞状细胞癌患者的生存率。FTH1P3异位表达能促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖与集落形成。此外，FTH1P3作为竞争的内源性RNA(开辟)，有效地成为mir-224-5p的海绵结构从而调节表达fizzled 5的表达。数据证实FTH1P3可以作为mir-224-5p的分子海绵调节fizzled 5的表达从而促进口腔鳞状细胞癌的进展[34]。Long intergenic non-coding RNA 00152 (LINC00152)长基因间非编码RNA 00152(LINC00152)是定位在染色体2p11.2上，转录长度为828个核苷酸的一种lncRNA。最近的研究表明胃癌中LINC00152的表达增加，且这种lncRNA在胃癌中发挥重要作用[35]。Yu J等[36]等从舌组织中获取的原发性口腔鳞状细胞癌样本中发现LINC00152也存在高度表达的现象且肿瘤中LINC00152的高水平与癌症进展、分化程度、癌症复发和侵袭有显著相关性。Kaplan Meier生存分析显示，口腔癌患者中LINC00152水平升高与总体生存率差之间存在显著相关性。这些发现表明LINC00152可能成为TSCC早期检测和预后评估的潜在生物标志物。

3 展 望

揭示癌症发生发展的分子机制可能有利于寻求更有效的策略来及早监测、诊断、判断愈后疗效。OSCC的发生发展是由多步骤多因素构成的极其复杂的生物学过程，该过程涉及遗传学，表观遗传学的进行性获得以及基因组的动态变化[37]。口腔鳞癌相关的lncRNAs可以在转录水平，转录后水平，表观遗传水平等多个方面发挥作用，通过调控基因表达、调节蛋白活性等方式参与癌症的发生发展。lncRNAs在肿瘤发生，转移，发展中的角色还有待进一步挖掘，但我们可以展望，随着芯片技术及高通量测序检测技术的运用，lncRNAs将会为肿瘤治疗开辟新的应用前景。