基于柑橘的多酵母协同发酵料酒的制备

李 欣,付彩霞,李军鹏,余红波,邹 涛,王 志,代 俊,陈 雄,陈世贵,*

(1.发酵工程教育部重点实验室,湖北省工业发酵协同创新中心,工业微生物湖北省重点实验室,湖北工业大学,湖北武汉 430068;2.湖北土老憨调味食品股份有限公司,湖北宜都 443302)

料酒是专门用于烹饪调味的酒,是调味品行业重要品类之一,在我国已有上千年的使用历史[12]。日本、美国、欧洲的某些国家也有使用料酒的习惯[3]。我国的传统料酒是用酿造黄酒浸泡香辛料制得。菌种方面,在充分利用自然微生物群系的基础上,为提高淀粉糖化效率和葡萄糖的乙醇转化效率,采用定向筛选技术挖掘高糖化酶活力的米曲霉和耐高温的高产乙醇酿酒酵母[78]。

近十几年来,随着人民生活水平的提高和对调味品新风味的追求,水果汁或蔬菜汁等被作为新风味的来源应用于调味品的产品。这些新辅料或作为发酵原料添加到黄酒或米酒的酿造过程中以制备料酒,或作为配制原料按照一定比例与黄酒或食用酒精混合来生产料酒[910]。柑橘富含丰富的生物活性[1113]和风味物质[14],已成功用于饮料果酒[1516]和传统酿造食品酱油[17]的生产。柑橘的应用为这些产品提供了新风味和新口感。

多菌种发酵策略是食品酿造工业中常用的策略,其最大优势既能利用不同微生物代谢特征提供丰富的代谢产物,如各种氨基酸和有机酸,又能赋予酿造食品独特的风味。在传统料酒生产中,酵母处于至关重要的地位。

本文以柑橘作为发酵主要原料,采用多酵母(乙醇酵母和风味酵母)协调组合发酵技术来制备柑橘型料酒。在最适发酵条件下,主要指标达到料酒质量标准,且柑橘风味显著,为开发柑橘型料酒产品奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母(Saccharomycecerevisiae)TLH 湖北土老憨调味食品股份有限公司;鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)CCTCC M 2013310、球拟酵母(Torulopsis) 本实验室从酱油中分离纯化获得;柑橘 湖北土老憨调味食品股份有限公司;乳酸标准品(50 mg/100 mL) 山东科学院生物研究所提供;3,5二硝基水杨酸(3,5dinitrosalicylic acid,DNS)(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖(食品级) 山东祥瑞药业有限公司;体积分数95%酒精(医用级) 武汉兴和达商贸有限公司;酵母粉、蛋白胨(生化试剂) 北京双旋微生物培养基制品厂;YEPD培养基 酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1000 mL,pH6.0。

SBA生物传感仪 山东省科学院生物研究所;AMR612型均质机 中国安蜜尔电器实业有限公司;BL75A型高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司公司;HNY211B型恒温摇床 天津欧诺仪器仪表有限公司;ZSDA1160A型恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司;CT15RE型离心机 日本日立公司;V1100D型可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;5804R型离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 柑橘料酒制备工艺流程如图1所示。

图1 柑橘料酒工艺流程Fig.1 The technological process of citrus cookingwine

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 柑橘处理方法 用75%乙醇对柑橘表面进行消毒,皮肉分离,再用经75%乙醇消毒处理的均质机分别均质破碎,8000 r/min离心10 min,收集柑橘肉和柑橘皮离心液于20 ℃保存,保存期不超过4周。

1.2.2.2 酵母菌活化及酵母泥制备方法 用无菌接种环从酵母活化斜面上取一环,接入YEPD培养基中,在30 ℃、200 r/min的条件下振荡培养18 h。培养结束后,取1 mL酵母活化液于8000 r/min离心10 min,收集离心沉淀作为酵母泥用于料酒发酵。1 mL酵母活化液所收集到的酵母泥定义为1份活化酵母泥。

1.2.2.3 活化酵母泥的加入 从发酵基液中吸取1 mL加入1份活化酵母泥中,用移液枪吹吸打散酵母泥,再全部转移至发酵基液中。

1.2.2.4 料酒发酵方法 含有柑橘组分、酵母泥和辅料的混合液,振荡混匀后于30 ℃条件下静置培养144 h。

1.2.3 柑橘组分对单一酵母发酵的影响 在初始葡萄糖浓度为60 mg/mL条件下,于不同体积分数的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁中添加一定浓度的活化酵母泥,振荡混匀后静置发酵,并每隔24 h取样进行检测,以分析鲁氏酵母、球拟酵母和酿酒酵母在不同体积分数的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁条件下的乙醇和乳酸积累规律。

1.2.4 协同酵母料酒发酵技术研究

1.2.4.1 初始葡萄糖浓度的确定 在同时接种混合酵母(酿酒酵母∶鲁氏酵母∶球拟酵母,1份∶1份∶1份)条件下,全柑橘汁中添加不同浓度的葡萄糖(20、60、120、180和240 mg/mL),振荡混匀后静置发酵,并每隔24 h取样用于检测残糖、乙醇和乳酸浓度。

1.2.4.2 初始酵母浸粉浓度的确定 在同时接种混合酵母(酿酒酵母∶鲁氏酵母∶球拟酵母,1份∶1份∶1份)条件下,在含有60 mg/mL葡萄糖的全柑橘汁中添加不同浓度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%和5%),振荡混匀后静置发酵,并每隔24 h取样用于检测残糖、乙醇和乳酸浓度。

1.2.4.3 三种酵母复配比例的确定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖全柑橘汁中(不添加酵母浸粉),按不同复配浓度(1份∶1份∶1份、2份∶1份∶1份、1份∶2份∶1份、1份∶1份∶2份、2份∶2份∶2份)加入酿酒酵母、鲁氏酵母合和球拟酵母,振荡混匀后静置发酵,并每隔24 h取样用于检测残糖、乙醇和乳酸浓度。

1.2.4.4 三种酵母复配顺序的确定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖和1%酵母粉的全柑橘汁中,按2份∶2份∶2份的比例和表1所示的添加顺序加入酿酒酵母、鲁氏酵母合和球拟酵母,振荡混匀后静置发酵,并每隔24 h取样用于检测乙醇和乳酸浓度。

表1 三种酵母添加组合策略Table 1 The adding strategy of three yeasts

1.2.5 测定方法 适量发酵样品在4 ℃、8000 r/min下离心10 min,收集上清液用于残糖、乳酸和乙醇的测定。

采用DNS(3,5二硝基水杨酸)比色法(540 nm)测定残糖浓度[18]。以响应值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,建立标准方程:y=1.4597x+0.01272,偏差R2为0.999。

采用SBA生物传感仪检测乙醇和乳酸浓度[1920]。其中乙醇标准液的配制:将25 μL无水乙醇加入100 mL容量瓶中,并用去离子水定容,所配得乙醇质量浓度为20 mg/100 mL。现用现配。

1.3 数据处理

每组实验3个平行。运用Excel计算平均值,并运用Origin 8.6软件对发酵数据作图。

2 结果与分析

2.1 柑橘组分对单一酵母发酵的影响

酿酒酵母具有显著的乙醇合成能力[21],鲁氏酵母和球拟酵母均是典型的风味形成酵母[22]。柑橘组分对微生物的生长可能存在不同的影响[2324],因此本研究分析这3种酵母在柑橘组分存在条件下的发酵能力差异,为建立组合酵母发酵生产料酒奠定基础。同时,调味料酒中的两个主要指标(乙醇和乳酸)被作为发酵评价的重要指标[25]。

2.1.1 柑橘组分对鲁氏酵母发酵影响 在初始葡萄糖浓度为60 mg/mL时,不同体积分数的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)对鲁氏酵母乙醇和乳酸积累的影响如图2A和2B。结果表明,在发酵的0～72 h,乙醇在持续积累,72 h后乙醇浓度逐渐降低。值得注意的是,柑橘果肉汁的含量越高,发酵过程中所积累的乙醇浓度越高。这表明高浓度的柑橘果肉汁对提高乙醇浓度具有正向效果。与乙醇生成转化不同的是,添加柑橘肉汁在0%～50%对乳酸积累的差异不大,但75%和100%柑橘肉汁浓度从48 h开始大量积累乳酸,最大乳酸积累浓度分别达到0.82和1.74 mg/mL。

图2 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)对鲁氏酵母乙醇(A和C)或乳酸(B和D)积累的影响Fig.2 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Zygosaccharomyces rouxii

添加有60 mg/mL初始葡萄糖的不同体积分数的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)对鲁氏酵母发酵的影响如图2C和2D所示。无论添加何种浓度的柑橘皮汁,其乙醇浓度均低于对照(%)。然而,在有柑橘皮汁存在情况下,除5%柑橘皮汁浓度外,乙醇的浓度都随着发酵时间的延长而增加。同时,最大乙醇积累浓度也随着柑橘皮浓度的提高而提高。在20%柑橘皮浓度下,最大乙醇积累浓度达到2.04 mg/mL。这些结果表明柑橘皮具有刺激鲁氏酵母合成乙醇的功能。柑橘皮对鲁氏酵母积累乳酸的影响与柑橘肉的作用截然不同。添加柑橘皮后,除对照和5%柑橘皮汁浓度外,乳酸水平分别在48 h(10%)、48 h和120 h(15%)、72 h(20%)达到最大,随后其浓度几乎维持恒定,保持在0.12～0.16 mg/mL之间。

2.1.2 柑橘组分对球拟酵母发酵影响 图3A和3B显示了在60 mg/mL的初时葡萄糖中添加不同体积分数的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)对球拟酵母积累乙醇和乳酸的影响。结果表明,柑橘果肉汁的添加能明显促进球拟酵母合成乙醇。乙醇经过第一阶段的缓慢积累(0～72 h,积累量为(4.00±0.50)mg/mL),和第二阶段的快速积累(72～120 h),至发酵终点其浓度在(25.00±3.00) mg/mL左右。这表明柑橘果肉汁具有刺激球拟酵母合成乙醇的作用,然而,这种刺激效应并不与柑橘果肉汁浓度有正向对应关系。乳酸浓度在发酵第72 h达到最大,并在发酵后期被利用。在大部分柑橘果肉汁浓度下,最大乳酸积累量在0.30 mg/mL,除50%浓度外(0.53 mg/mL)。可见,柑橘果肉汁的添加有助于球拟酵母大量合成乙醇,且不会引起乳酸水平的提高。

图3 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)对球拟酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)积累的影响Fig.3 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Torulopsis

图3C和3D展现了含有60 mg/mL初始葡萄糖的不同体积分数的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%、或20%)对球拟酵母积累乙醇和乳酸的影响。与对鲁氏酵母的影响相似,无论添加何种浓度的柑橘皮汁,球拟酵母所积累的乙醇浓度均没有对照高。然而,在添加有柑橘皮汁的情况下,柑橘皮汁有助于在发酵早期提高球拟酵母的乙醇产量,且产量提高程度与柑橘皮汁的添加浓度有正相关性。但在发酵48 h后,除15%柑橘皮浓度外,乙醇的浓度不再增加,甚至会有所下降。添加柑橘皮汁后,乳酸浓度表现为倒V字形变化过程,在72 h乳酸浓度达到最大。添加10%、15%和20%柑橘皮汁的发酵液中所得到的最大乳酸积累浓度相同,均在72 h达到0.30 mg/mL。这表明添加高浓度的柑橘皮汁不会促进球拟酵母大量积累乳酸。

2.1.3 柑橘组分酿酒酵母发酵料酒影响 含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同体积分数的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)对酿酒酵母积累乙醇和乳酸的影响如图4A和4B。无论是何种柑橘果肉汁浓度,在整个发酵周期,乙醇的浓度经历了缓慢增长(0～72 h)、快速积累(72～96 h)、快速降低(96～120 h)和维持稳定(120～144 h)四个变化阶段,而且乙醇的最大积累浓度与柑橘果肉汁体积分数的增长表现为正相关性。最大柑橘果肉汁体积分数下,其最大乙醇积累浓度为138.00 mg/mL(96 h)。无论添加多少柑橘果肉汁,乳酸在发酵早期都会持续积累,但在发酵的72～96 h期间,乳酸浓度都维持在0.10 mg/mL的水平上,随后其浓度逐渐降低。

图4 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)对酿酒酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)积累的影响Fig.4 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Saccharomyce cerevisiae

含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同体积分数的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)对酿酒酵母积累乙醇和乳酸的影响如图4C和4D。乙醇的大量积累发生在72～96 h,随后乙醇浓度快速下降。对乙醇而言,柑橘皮汁最佳添加浓度为10%,其最大乙醇积累浓度接近180 mg/mL。值得注意的是,在72～96 h发酵阶段积累的乙醇浓度与96～120 h阶段所减少的浓度非常相近,前者平均值为123.40 mg/mL,后者平均值为119.60 mg/mL,这表明发酵的有效积累乙醇浓度并不高。虽然柑橘皮汁的对酿酒酵母乙醇合成的刺激作用明显,但发酵液中乙醇水平不稳定,使得发酵终点的乙醇浓度达不到目标。在不添加柑橘皮汁时,最大乳酸积累量首次出现在发酵第72 h。添加柑橘皮汁后,除20%条件外,其余3种条件下的乳酸浓度都在48 h达到最大,且在随后的发酵期间,乳酸浓度均在(0.10±0.02) mg/mL波动,与对照处于相似的水平。这样的结果表明柑橘皮汁对酿酒酵母发酵期间的乳酸没有影响。

为充分利用酿酒酵母和风味酵母(鲁氏酵母和球拟酵母)的特性,为进一步提高乙醇的浓度,混合酵母发酵柑橘料酒。上述研究结果表明柑橘果肉汁比柑橘皮汁更有利于料酒发酵,能有效提升3种酵母的乙醇合成水平。因此后续研究采用全柑橘汁(100%)作为发酵基液,并进一步优化了料酒发酵的工艺条件,包括葡萄糖和酵母粉的初始浓度、三种酵母的复配比例和浓度及添加顺序等。

2.2 协同酵母料酒发酵技术研究

2.2.1 初始葡萄糖浓度优化 酿酒酵母、鲁氏酵母和球拟酵母对葡萄糖均有良好的利用能力。为避免三种酵母共酵条件下出现碳源不足从而导致生长代谢活性的减弱，本研究首先优化了初始葡萄糖浓度。图5A显示，初始葡萄糖浓度越高，残留的葡萄糖浓度越高，这表明三种酵母的共存并没有完全利用葡萄糖。这可能是三种酵母的生长受到某种相同因素的限制。图5A显示,初始葡萄糖浓度越高,残留的葡萄糖浓度越高,这表明同时添加三种酵母会降低葡萄糖的利用率。这可能是三种酵母的生长受到某种相同因素的限制。

图5 不同初始葡萄糖浓度对混合酵母发酵过程中残糖(A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影响Fig.5 Effects of different initial glucose concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

图5B结果显示,当葡萄糖浓度从20 mg/mL提高到60、120 mg/mL时,乙醇的浓度并没有同步增加,最大乙醇浓度不超过6.00 mg/mL。然而,当葡萄糖浓度继续提高到180、240 mg/mL后,乙醇开始大量积累,最大乙醇浓度分别达到9.20、13.20 mg/mL。这些结果表明,三种酵母在高浓度和低浓度葡萄糖下可能具有截然不同的代谢和相互作用。可见,高浓度的初始葡萄糖浓度更有利于乙醇的大量积累。

图5C显示,在发酵前中期(0～96 h),除60、120 mg/mL初始葡萄糖浓度条件下的乳酸浓度几乎检测不到,其它条件下的乳酸浓度在0.06 mg/mL上下振荡。然而,发酵96 h后,初始葡萄糖浓度20 mg/mL中的乳酸浓度开始大幅上升至0.28 mg/mL,其它浓度条件下的乳酸浓度或下降或检测不到。表明高浓度的初始葡萄糖会抑制乳酸的积累。这可为我们调控发酵过程中的乳酸积累量提供了一种手段。

义109-3井固井技术研究……………………………………………………………………………桂成梁，孙 钰，赵清忠（1.8）

2.2.2 初始酵母浸粉浓度对料酒发酵影响 图6A显示,在不加入酵母浸粉时,发酵终点的残糖浓度为28.76 mg/mL。但添加1%酵母浸粉后,60 mg/mL葡萄糖在72 h被消耗完。当进一步提高酵母浸粉的浓度,葡萄糖消耗更迅速,24 h即被消耗完。可见,酵母浸粉能促进混合发酵过程中酵母对葡萄糖利用。同时,添加酵母浸粉也显著提高了乙醇的积累量,如图6B。然而,无论添加多大浓度的酵母浸粉,发酵过程中的最大乙醇积累浓度均在20 mg/mL左右。值得注意的是,整体趋势上，除对照外,酵母浸粉初始浓度越高,发酵终点的乙醇浓度越低。乳酸积累浓度与酵母浸粉浓度表现出正相关性关系。5%的酵母浸粉浓度下的最大乳酸积累量达到2.09 mg/mL,而1%的酵母浸粉中只有0.78 mg/mL的最大乳酸积累量。

图6 不同初始酵母浸粉浓度对混合酵母发酵过程中残糖(A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影响Fig.6 Effects of different initial yeast powder concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

综合初始葡萄糖和酵母粉的实验结果,在同时添加酿酒酵母、鲁氏酵母和球拟酵母进行共发酵条件下,初始葡萄糖浓度不低于120 mg/mL,而初始酵母浸粉浓度不高于1%,既满足乙醇的大量积累,也能避免乳酸的积累。

2.2.3 组合酵母的添加量对料酒发酵影响 由图7A可知,在发酵期间,葡萄糖被持续消耗。三种酵母不同复配比例的差异主要体现在发酵终点的残糖上。同时提高三种酵母的接种量所残留的葡萄糖浓度最少,为36.54 mg/mL(接近初始葡萄糖浓度的1/4),而只提高鲁氏酵母的接种量所残留的糖浓度是最高的,为66.52 mg/mL(几乎为初始葡萄糖浓度的一半)。

图7 组合酵母添加量(酿酒酵母∶鲁氏酵母∶球拟酵母)对葡萄糖消耗(A)、乙醇(B)和乳酸(C)积累的影响Fig.7 Effect of different adding concentration of three yeasts(S. cerevisiae,Z.rouxii and Torulopsis)on glucose consumption(A),ethanol(B)and lactate concentration(C)

无论提高何种酵母细胞的添加量都能明显增加发酵液中乙醇的水平,而三种酵母的添加量都提高到2%所获得乙醇浓度最大(19.20 mg/mL左右)。更重要的是,三种酵母接种量同时提高后,乙醇浓度在发酵后期没有明显的下降,这将非常有利于料酒的发酵。提高任意一种酵母的接种量都会导致乳酸浓度的增加,但是同时提高三种酵母的接种量却不会造成乳酸积累最大化,反而只是提高球拟酵母的接种量能明显促进乳酸的积累,其最大积累浓度为0.18 mg/mL。

2.2.4 酵母添加顺序对料酒发酵影响 上述研究结果显示出,在同时添加酿酒酵母、球拟酵母和鲁氏酵母情况下,三种酵母之间可能存在相互影响。为掌握三种酵母之间的互作规律,三种酵母的添加比例顺序被优化。实验参数采用上述确定的发酵最优初始条件:在1 L全柑橘汁中添加160 g葡萄糖和10 g酵母浸粉。实验设计和结果如表2。结果表明,单一降低酿酒酵母的接种量,都将导致发酵终点的乙醇浓度降低。同时,三种酵母的添加顺序对发酵终点的乳酸浓度没有显著影响,所有实验组中的乳酸浓度都分布在0.11～0.14 mg/mL。但是,三种酵母的添加比例和顺序对发酵终点的乙醇浓度却有显著的影响。最佳添加比例和顺序为:在发酵初期加入2%酿酒酵母细胞活化液,在发酵第24 h再加入2%球拟酵母细胞活化液,最后在发酵第48 h加入2%鲁氏酵母细胞活化液。在此工艺下,发酵终点的乙醇浓度达到145.00 mg/mL。

表2 不同时间点添加酵母对酿造产乙醇和乳酸的影响Table 2 Effect of the addition of yeasts at different time point on ethanol and lactate content

3 结论

柑橘肉汁和柑橘皮汁对鲁氏酵母、球拟酵母和酿酒酵母发酵料酒具有差异性影响。添加一定柑橘肉汁和柑橘皮汁均能刺激鲁氏酵母提高乙醇和乳酸的积累量。柑橘肉汁有利于球拟酵母积累乙醇,而柑橘皮汁会抑制乙醇的积累。当使用酿酒酵母时,柑橘肉汁对乳酸的影响比较大,而柑橘皮汁除了能刺激酵母利用糖外,对乙醇和乳酸无大的影响。可见,柑橘肉汁比柑橘皮汁更适合作为料酒发酵基液,有利于提高乙醇浓度并控制乳酸的积累。在料酒发酵过程中,可以将酿酒酵母作为乙醇的主要来源,而三种酵母菌的混合使用不会引起乳酸的大量积累。

通过研究初始葡萄糖和酵母浸粉浓度、三种酵母组合添加工艺等因素对发酵过程中的残糖、乙醇和乳酸积累的影响,确定柑橘型料酒的最优发酵初始条件为:1 L全柑橘肉汁中添加的160 g葡萄糖和10 g酵母粉;三种酵母的接种浓度和体积比例为2∶2∶2;组合酵母最佳添加顺序为:酿酒酵母在发酵初期就加入,发酵24 h加入球拟酵母,并继续发酵24 h后加入鲁氏酵母。在此最适条件下静置发酵168 h后,乙醇和乳酸的浓度分别达到145.00和0.11 mg/mL。本研究结果为柑橘料酒产品的开发提供了理论基础和实践指导。

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