加气条件下土壤N2O排放对硝化/反硝化细菌数量的响应

陈　慧　李　亮　蔡焕杰　朱　艳　王云霏　徐家屯

(1.西北农林科技大学水利与建筑工程学院， 陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学中国旱区节水农业研究院， 陕西杨凌 712100；3.西北农林科技大学旱区农业水土工程教育部重点实验室， 陕西杨凌 712100)

0　引言

因此，本文以温室番茄地土壤为试验材料,研究不同加气和灌水量对番茄地土壤N2O气体排放、水分、温度、硝化细菌、反硝化细菌数量和硝态氮含量的影响。以期揭示加气灌溉及不同灌水量下土壤N2O气体排放对土壤硝化细菌、反硝化细菌数量和硝态氮含量的响应，为深入研究硝化细菌和反硝化细菌在设施菜地氮素循环中的作用奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验区概况

试验于2016年8—12月在西北农林科技大学旱区农业水土工程教育部重点实验室的日光温室内进行(北纬34°20′，东经108°24′，海拔高度为521 m)，年均日照时数为2 163.8 h，无霜期为210 d。温室内土壤类型为塿土，质地为粘壤土，表层土壤容重为1.35 g/m3，田间持水率(质量含水率)为23.8%，有机碳质量比为9.51 g/kg，总氮质量比为1.86 g/kg，总磷质量比为1.40 g/kg，总钾质量比为20.22 g/kg，pH值为7.65，砂粒(0.05～1.00 mm)占26.0%，粉粒(0.005～0.05 mm)占33.0%，黏粒(0～0.005 mm)占41.0%。

1.2　试验设计

研究表明，土壤田间最大持水率的60%为日光温室番茄栽培的适宜灌水下限[20]。适时灌溉的方法包括固定灌水时间间隔、固定水分亏缺和固定蒸发量[21]，本文采用固定灌水时间间隔方法，灌水周期为3～4 d灌1次[7]，保证作物不受水分胁迫且呈现正常的生长状况。试验设置0.6W、0.8W和1.0W3个灌水定额，其中W代表充分供水的灌水量，由安置在温室内的E601型蒸发皿测得的蒸发量确定，计算方法见文献[9,22]；每个灌水定额又设置加气和不加气处理，共计6个处理，如表1所示。每个处理设置3个重复，1垄作为一个重复布设于田间，共计18垄，采用完全随机设计。每垄3.2 m2(4.0 m×0.8 m)，种11株番茄(品种为“金鹏10号”)，株距35 cm[7]。灌水方式采用地下滴灌，滴灌带埋深15 cm，滴头间距35 cm；移苗后于8月23日在垄上覆膜。利用文丘里计(Mazzei 287型，美国)作为加气设备进行加气。设备安装在灌水毛管的首端，在进水口和毛管末端都装有压力表，灌水时通过水泵形成加压灌溉水，同时调节灌水总管道末端调节阀，保证进口压力为0.1 MPa，出口压力为0.02 MPa，由排气法得到进气量约占灌溉水量的17%[7]。

表1　试验设计方案Tab.1　Experimental design

注：√表示加气。

番茄幼苗于2016年8月17日定植，此时幼苗处于3叶1心至4叶1心；于2016年12月31日收获。为了保证幼苗的成活，番茄移植当天及8月20日对土壤浇透底水。此外，试验施肥只施基肥，施有机肥料(N-P2O5-K2O含量大于等于10%；有机质含量大于等于45%)与复混肥料(总养分大于等于45%，其中氮、磷、钾各含15%)。

1.3　测定指标及方法

土壤N2O气样采用静态暗箱法采集[9]，采样箱由箱体和底座构成。箱体由6 mm厚的聚氯乙烯(PVC)材料制成，长、宽和高各为25 cm。箱体外表面用海绵与锡箔纸包裹，顶部安装有搅拌空气的小风扇，使取样具有代表性。静态箱底座(25 cm×25 cm)在番茄移植当天埋设于每垄中央2棵幼苗之间[22]，底座嵌入土壤5 cm深，作为采样点，直到番茄收获；番茄生育期内进行人工除杂草。此外，底座上端附有大约3 cm深的凹槽，用以放置静态箱箱体，取样时注水密封以隔绝箱外环境[22]。气体采样从移苗后第7天开始，除去9月5日、9月24日及9月29日这3个点，番茄生育前期每隔5～7 d采集1次气样；番茄生育后期平均每隔8 d采集1次气样。气体取样时间分别在10：00、10：10、10：20和10：30利用带有三通阀的50 mL注射器进行4次气体采集，每次取气30 mL，并在当天进行浓度分析。去除奇异点，使4个样品浓度测量值随时间的线性回归系数R2≥0.90。

N2O浓度采用安捷伦气相色谱仪分析仪测定(AgilentTechnologies 7890A GC System，美国)，气体排放通量计算公式[9]为

(1)

式中F——N2O气体排放通量，μg/(m2·h)

ρ——标准状态下气体密度，g/cm3

h——箱体高度，m

T——箱内温度，℃

硝化细菌和反硝化细菌数量，采用最大或然数计数法(MPN)测定，利用硝化和反硝化细菌培养基，均在30℃条件下培养14 d。其中硝化细菌的培养基成分有：NaH2PO40.25 g、K2HPO40.75 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.01 g、Na2CO31.0 g和NaNO31.0 g；反硝化细菌的培养基成分有：柠檬酸钠 5 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.2 g。

1.4　数据处理分析

用OriginPro 8.5绘图；采用SPSS Statistics 22.0数据处理软件对试验数据进行显著性分析和相关性分析。

2　结果与分析

2.1　不同灌溉方式下土壤N2O排放的变化规律

如图1a所示，不同加气灌溉及灌水量处理下土壤N2O排放通量表现出明显的变化规律。25 d前，土壤N2O排放通量呈下降的趋势；之后，N2O气体维持在相对较低且稳定的排放水平。处理间对比显示，番茄生育期绝大多数时间内，不同灌水定额加气处理的土壤N2O排放通量高于对应不加气处理；且高灌水处理土壤N2O排放通量高于低灌水处理。AI0.6、CK0.6、AI0.8、CK0.8、AI1.0和CK1.0处理土壤N2O排放通量分别在7.25～21.72 μg/(m2·h)、8.01～20.89 μg/(m2·h)、7.51～20.62 μg/(m2·h)、7.55～21.99 μg/(m2·h)、7.86～23.10 μg/(m2·h)和6.88～20.24 μg/(m2·h)之间变化。

各处理土壤N2O累积排放量在番茄整个生育期内不断增加(图1b)，说明土壤作为N2O气体排放源，在不断地释放气体。0.6W、0.8W和1.0W3个灌水定额下，加气较不加气处理分别增加了2.7%、1.5%和10.1%的土壤N2O累积排放量，平均增加4.7%。此外，CK0.6、CK0.8和CK1.0处理土壤N2O排放量分别为0.315、0.321、0.324 kg/hm2。即随着灌水量增加，土壤N2O累积排放量在增加，平均增幅1.9%。方差分析表明，加气或灌水单因素对土壤N2O排放产生影响，但不显著(加气：P=0.067；灌水：P=0.156)；且加气和灌水的交互作用对土壤N2O排放影响也未达到显著水平(P=0.820，表2)。

图1　不同灌溉处理土壤N2O排放通量和土壤N2O累积排放量的变化规律Fig.1　Changing patterns of soil N2O fluxes and cumulative N2O emissions under different irrigation modes

表2　番茄全生育期土壤N2O累积排放量以及土壤充水孔隙率、温度、硝化细菌数量、反硝化细菌数量和硝态氮含量均值Tab.2　Cumulative N2O emissions and mean values of WFPS, soil temperature, nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and nitrate content throughout whole growth period of tomato

注：同一列数值后不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.2　影响土壤N2O排放的环境因子

2.2.1土壤水分和温度

随着时间推移，由于土壤蒸发及番茄生长消耗，各处理WFPS总体呈现逐渐降低的趋势；且处理间的差异不明显(P>0.05，图2a)。AI0.6、CK0.6、AI0.8、CK0.8、AI1.0和CK1.0处理WFPS分别在40.1%～62.4%、39.7%～64.4%、42.1%～60.7%、42.0%～64.6%、40.6%～61.8%和41.2%～62.3%之间变化，平均WFPS分别为49.9%、48.8%、50.1%、49.5%、50.1%和49.6%。此外，受大气温度和土壤水分的影响[24]，随着番茄移植后天数增加，不同灌溉处理的土壤温度大体呈现下降的趋势(图2b)。各处理土壤温度分别在7.27～30.2℃、8.47～30.5℃、8.0～30.5℃、9.0～30.3℃、7.5～29.3℃和9.0～30.0℃范围变化，平均温度分别为17.2、17.7、17.3、17.8、17.3、18.0℃。相关性分析表明(表3)，不同灌溉处理土壤水分与土壤温度呈极显著正相关关系(P=0.000)；土壤N2O排放通量与土壤水分和土壤温度也均呈极显著正相关关系(P<0.01)。

图2　不同灌溉处理0～20 cm土壤充水孔隙率、5 cm土壤温度与距离地面1.5 m高处空气温度的变化规律Fig.2　Changing patterns of WFPS in 0～20 cm depth, soil temperature at a depth of 5 cm and air temperature in distance of 1.5 m high from ground under different irrigation modes

2.2.2不同灌溉方式下土壤硝化细菌数量变化规律

由图3可知，不同加气和灌水量在番茄不同生育期对土壤硝化细菌数量影响不同。AI0.6、CK0.6、AI0.8、CK0.8、AI1.0和CK1.0处理土壤硝化细菌数量分别在2.185×103～3.910×103个/g、2.159×103～3.377×103个/g、2.290×103～3.335×103个/g、1.414×103～3.715×103个/g、2.380×103～3.840×103个/g和2.207×103～3.850×103个/g之间变化。对比番茄整个生育期土壤硝化细菌数量均值可以发现(表2)，不同灌水定额的加气处理较不加气处理增加了土壤硝化细菌数量，0.6W、0.8W和1.0W3个灌水定额分别增加了2.4%、1.1%和2.8%，增幅均未达到显著水平(P>0.05)。此外，番茄整个生育期土壤硝化细菌数量均值随着灌水量增加呈现逐渐增加的趋势，由小到大为CK0.6、CK0.8、CK1.0。相关性分析可知(表3)，土壤N2O排放通量与硝化细菌数量呈负相关关系，但相关性不显著(P>0.05)。

2.2.3不同灌溉方式下土壤反硝化细菌数量变化规律

不同灌溉处理土壤反硝化细菌数量在番茄整个生育期内总体呈现先升高后下降的趋势(图4)。

表3　土壤N2O排放通量、WFPS、温度、硝化细菌数量、反硝化细菌数量和硝态氮含量的相关系数Tab.3　Correlation coefficient among soil N2O fluxes, WFPS, soil temperature, nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and nitrate content

注：*表示相关性达到P<0.05，** 表示相关性达到P<0.01。

图3　不同灌溉处理土壤硝化细菌数量变化规律Fig.3　Changing pattern of nitrifying bacteria under different irrigation modes

图4　不同灌溉处理土壤反硝化细菌数量变化规律Fig.4　Changing pattern of denitrifying bacteria under different irrigation modes

AI0.6、CK0.6、AI0.8、CK0.8、AI1.0和CK1.0处理土壤反硝化细菌数量分别在4.67×102～2.323×103个/g、3.32×102～2.10×103个/g、4.03×102～2.295×103个/g、4.28×102～1.615×103个/g、5.31×102～1.740×103个/g和7.27×102～1.418×103个/g之间变化。对比番茄整个生育期土壤反硝化细菌数量均值可以发现(表2)，不同灌水定额的加气处理较不加气处理减小了土壤反硝化细菌数量，0.6W、0.8W和1.0W3个灌水定额分别减小了13.7%、4.7%和10.6%，降幅均未达到显著水平(P>0.05)。此外，番茄整个生育期土壤反硝化细菌数量均值随着灌水量增加呈现增加的趋势，由小到大为CK0.6、CK0.8、CK1.0。相关性分析得出(表3)，土壤N2O排放通量与土壤反硝化细菌数量呈极显著负相关关系(P<0.01)；反硝化细菌数量与土壤温度呈显著正相关关系(P<0.05)，与WFPS也呈正相关关系，且加气条件下相关性显著(P<0.05)。

2.2.4不同灌溉方式下土壤硝态氮含量变化规律

不同灌溉处理0～20 cm深度层土壤硝态氮含量在番茄整个生育期内呈波动性变化，且保持在较高水平；加气和灌水处理对不同时期土壤硝态氮含量影响不同(图5)。由表2可知，不同灌水定额的加气处理较不加气处理增加了番茄整个生育期的土壤硝态氮含量，但不明显(P>0.05)；且随着灌水量增加，土壤硝态氮含量表现为增加的趋势，由小到大为CK0.6、CK0.8、CK1.0。方差分析表明，加气和灌水的交互作用对土壤硝态氮含量影响不明显(P>0.05)。此外，相关分析可知(表3)，土壤硝态氮含量与WFPS和土壤温度呈显著负相关关系(P<0.05)；土壤N2O排放通量与土壤硝态氮含量呈正相关关系，但相关性不显著(P>0.05)。

图5　不同灌溉处理土壤硝态氮含量变化规律Fig.5　Changing pattern of nitrate content under different irrigation modes

3　讨论

3.1　加气灌溉及不同灌水量对土壤N2O排放的影响

番茄生育前期，不同处理土壤N2O排放通量呈下降的趋势，25 d后N2O气体维持在较低且稳定的排放水平(图1a)。该现象在前人研究中也有出现[25-26]，如徐钰等[25]和ZHANG等[26]指出设施菜地N2O排放呈“脉冲式”变化规律，峰值出现在施肥并灌溉后的一段时间内。导致这种现象的原因有2点：①番茄生育前期供N2O气体产生的基质较多，而植物对氮素吸收量小，大部分氮源被微生物利用，加之缓苗期大量灌水造成土壤湿润，利于气体排放。②番茄生育后期植株生长对氮素吸收量增大，土壤微生物可利用氮源减小[25]，造成气体排放逐渐下降并维持在较低排放水平。

加气灌溉通过向作物根区输送O2，已被证实能改善土壤通气性[5-7]，势必改变了硝化和反硝化反应条件，进而影响土壤N2O产生和排放。本研究中，不同灌水定额的加气处理均较不加气处理增加了土壤N2O排放(图1、表2)，这与先前研究的结论一致[9-10]。产生这种现象的可能原因是，由加气灌溉引起的土壤O2含量增加[7]，抑制N2O向N2转化[9]；此外，PAN等[16]指出间歇性曝气将使硝化和反硝化反应同时发生。以上皆证明了加气促进土壤N2O排放。

灌水对土壤通气性和氮素转化产生影响，进而影响土壤N2O产生和排放[27-28]。本试验中，土壤N2O排放量随灌水量增加呈现逐渐增加的趋势(表2)，这与不少研究学者的结论一致[29-30]。例如，TRUJILLO-TAPIA等[29]通过室内试验发现100%田间持水率(Water holding capacity，WHC)处理的土壤N2O排放至少是40%WHC处理的40倍；PONCE-MENDOZA等[30]指出高灌水处理(100%WHC)土壤N2O排放量是低灌水处理(40%WHC)的32倍。其主要由于土壤含水率增加将引起硝化细菌脱氮和反硝化作用[31]，进而产生较高的N2O气体排放。

3.2　加气灌溉及不同灌水量对土壤硝化和反硝化细菌的影响

曝气不仅影响硝化细菌的代时，还将影响微生物的生长繁殖速度[32]，进而对硝化细菌数量产生影响。土壤中O2含量的改变直接影响反硝化酶的合成及其活动[33-34]，从而对反硝化作用产生影响。本研究发现，加气总体增加了土壤硝化细菌数量，但减小了反硝化细菌数量(表2)，这与一些研究结果相似。比如，FAN等[15]和PAN等[16]研究发现O2含量增加使得硝化细菌活性增加。但PAN等[16]指出间歇曝气增加了反硝化细菌活性，这与本文结果不同。产生差异的可能原因是本试验是在田间进行，由于土壤本身性质，由动物引起的土壤差异不足以引起微生物活性产生明显的变化[35]，这异于地下污水入渗系统[16]。加气灌溉增加土壤硝化细菌数量，这可能由于硝化细菌的碳源是CO2[32]，而加气灌溉已被证实能增加土壤CO2排放[5,22]。

多数研究认为，在田间持水率的50%～60%时，土壤中的硝化作用最为旺盛[13]；当土壤含水率为田间持水率的80%或40%时均会对硝化反应产生抑制作用[12]。张光亚等[36]研究发现，灌水处理硝化细菌数量是未灌水处理的22.6%，反硝化细菌数量却是未灌水处理的5.2倍。本试验中，番茄全生育期土壤硝化细菌和反硝化细菌数量均值均随着灌水量增加呈现逐渐增加的趋势(表2)。而贾正茂等[37]指出，随着灌水量的增加，土壤总硝化速率呈先减小后增加的趋势；反硝化速率呈现逐渐增加的趋势。韩冰等[38]指出设施土壤反硝化细菌丰度随灌水量增加呈现先减小后增加的趋势，由小到大为滴灌、渗灌、沟灌。白保勋等[18]得出土壤硝化细菌和反硝化细菌数量均随着灌水量增加呈现先增加后减小的趋势。产生差异的可能原因是由于作物种类、种植环境及灌水方式等不同引起的。

3.3　土壤N2O排放对WFPS、温度、硝化/反硝化细菌数量和的响应

土壤中水分的分布影响溶质的迁移，影响土壤无机氮浓度的分布及其对微生物的有效性，从而对土壤N2O气体产生影响[39]。温度不仅影响土壤微生物的活性和生化反应速率，还影响着调节土壤中N2O传输速率的物理化学参数。本试验中，不同处理土壤N2O排放通量与WFPS和土壤温度均呈极显著正相关关系(P<0.01，表3)，这与一些研究学者的结论一致[26, 38, 40-42]。例如，ZHANG等[26]指出菜地土壤N2O排放通量与WFPS(R=0.180)和温度(R=0.289)呈显著正相关关系。韩冰等[38]得出设施番茄地土壤N2O排放与土壤湿度呈极显著正相关关系。王艳丽等[40]指出黄瓜生长季中不同处理土壤N2O排放通量与WFPS 之间呈显著正相关，芹菜生长季中不同处理土壤N2O排放通量与土壤5 cm温度呈显著正相关，且均可以用对数方程进行拟合。WESLIEN等[42]指出胡萝卜种植系统中土壤N2O排放通量与WFPS呈显著正相关关系(R=0.50) 。可见，不同管理措施下土壤水分和土壤温度是影响N2O排放的主要因素。

土壤N2O排放通量与硝化和反硝化细菌数量均呈负相关关系(表3)。而XU等[43]得出菜地土壤N2O排放通量与氨氧化细菌(AOB)、反硝化细菌nirK和nirS丰度呈正相关，与反硝化细菌nosZ丰度呈显著负相关关系。韩冰等[38]指出设施番茄地土壤N2O排放与反硝化细菌nosZ丰度呈极显著正相关(P<0.01)。产生差异的可能原因是试验处理及种植环境等不同所致。

4　结论

(1)与不加气处理相比，加气处理土壤N2O排放量平均增加了4.7%；且随着灌水量增加土壤N2O排放也在增加，平均增加了1.9%，但处理间差异性均未达到显著水平(P>0.05)。

(2)灌水和加气对温室番茄地土壤氮素转化细菌数量有一定影响。向土壤中通气总体增加了土壤硝化细菌数量，但减小了反硝化细菌数量(P>0.05)。随着灌水量增加，土壤硝化细菌和反硝化细菌数量均逐渐增加(P>0.05)。

(3)土壤N2O排放通量与土壤硝化细菌和反硝化细菌数量均呈现负相关关系，且与土壤反硝化细菌数量达到极显著关系(P<0.01)。

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