山羊乳饼中乳酸菌的分离鉴定及优良乳酸菌的初步筛选

马青雯，王馨聆，王昱敬，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明650201）

0 引言

乳酸菌广泛存在于自然界中，是国际公认的食品安全级微生物（GRAS）[1]。乳酸菌要在人体内发挥良好的作用与乳酸菌自身的性能有关，除了在肠道内达到一定数量之外，对肠胃环境中高酸度、胆盐、胆汁、胰酶等具有一定的耐受性才能顺利达到肠胃内部实现定殖[2]。

乳饼是是云南三大传统乳制品之一，至今已有600多年历史[3]。经过长期的自然驯化，乳饼及乳清中富含的乳酸菌及其生物学特性得到了很好的保存。杨希良，王昱敬[4]，杨玉森[5]等对乳饼中的乳酸菌进行了研究，但至今关于乳饼中优良乳酸菌的筛选鲜有报道。本研究旨在对云南大理地区传统乳饼中的乳酸菌进行分离鉴定，并筛选特性优良的乳酸菌，为云南地区益生特性优良乳酸菌的开发利用提供数据。

1 实验

（1）菌种和细胞：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus，LGG）为云南农业大学畜产中心保藏；人肠上皮细胞HT-29购自中国科学院昆明动物研究所。

（2）试剂：MRS培养基，M 17培养基，RPM I-1640培养基，PBS缓冲液，改良型RPM I-1640培养基，胰酶，0.1%的T riton-X 100，0.4%台盼蓝，胎牛血清（Fetalbovine serum,FBS-Standard）。

（3）仪器：倒置显微镜（AE200），澳柯玛超低温冰箱（DW-86L390），紫外可见分光光度计（A360），二氧化碳培养箱（1PH-460），尼康光学显微镜（E200），生物安全柜（HF-safe-1200LC）。

2 方法

2.1 样品的采集

6份山羊乳饼样品采集自云南省大理市白族地区，采样地点如表1所示。严格按照文献[6]的方法进行样品的采集。样品带回实验室后放入4℃冰箱中保藏[7]。

表1 山羊乳饼采样地点

2.2 乳酸菌的分离鉴定

2.2.1 乳酸菌的分离、纯化与初步鉴定

将样品进行研磨后放入质量分数为0.9%的生理盐水中进行10倍梯度稀释，采用倾注法培养微生物[8]。根据菌落形态特征，划线分离纯化3次后挑取单菌落于M RS培养液中培养24 h后进行革兰氏染色镜检、过氧化氢酶实验及培养液pH值测定，确定纯种，革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株置于-80℃的超低温冰箱中保藏。

2.2.2 乳酸菌16S rRNA序列鉴定

将分离纯化后的乳酸菌用16S rRNA基因序列分析法进行鉴定，其中DNA的提取使用DNA提取试剂盒，PCR方法参照文献[6]。PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行的双向测序，得到序列后利用SeqM an软件进行序列拼接，获得约1 500 bp的有效序列[9-10]，登陆 NCBI（www.ncbi.n lm.gov/blast/）网站，进行同源性分析和序列比对。

2.3 益生菌株的筛选

2.3.1 耐酸性实验

参照文献[11]配制人工胃液。将分离鉴定得到的乳酸菌进行活化，取传至第3代菌株按体积分数5%,分别接种于pH值为6.2，3.5，3，2.5的模拟胃液中,以pH值为6.2的模拟胃液为对照组，于37℃下恒温培养。在培养0和2 h[12]后稀释涂板，用平板计数法测定活菌数，根据活菌数判定乳酸菌的耐酸情况。

存活率计算公式：存活率=（处理组活菌数/对照组活菌数）×100%。

2.3.2 小肠液耐受性实验

模拟小肠液的配制参照文献[13]中方法。取传至第3代菌株按体积分数5%分别接种于小肠液质量分数为0.1%，0.30%，0.50%的MRS液体培养基中；于37℃下恒温培养，在培养0 h和6 h后稀释涂板，利用平板计数法测定实验菌株活菌数。

2.3.3 黏附实验

HT-29细胞的培养参照文献[14]；活菌数的测定参照文献[15]。

黏附实验：参考K im[16]的实验方法稍加改变。采用PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，选择适宜的3个梯度涂板，每个处理作3个平行，38℃培养48 h后计算平均每个细胞黏附的细菌数，并与参考菌株鼠李糖杆菌（LGG）比较。

3 结果与讨论

3.1 乳酸菌的分离鉴定

3.1.1 分离菌株的理化特性

6份样品中分离的46株乳酸菌的理化特性如表2所示。

由表2可以看出：在6份样品中分离出46株菌，46株菌革兰氏染色均呈阳性，过氧化氢酶实验46株菌均呈阴性。46株菌的培养液pH值最低为4.17，pH值最高为4.68。由菌株形态学特征和理化特性可鉴定出46株疑似乳酸菌。奎梦漪[17]从20份成熟酸菜样品中分离出12株乳酸菌，王昱敬[18]从9份传统乳扇样品中分离出32株乳酸菌，张振宇[19]从3份传统傣家酸鱼中分离到10株菌，本研究结果与以上报道相似。

3.1.2 乳酸菌16S rRNA序列鉴定结果

46株疑似乳酸菌的16S rRNA序列鉴定结果如表3所示。

6份大理羊乳饼样品中分离出的46株乳酸菌，通过16S r RNA基因序列对比，有3个属：肠球菌（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）、链球菌（Streptococcus），6个种：马肠链球菌（Streptococcusequi）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、解没食子酸链球菌（Streptococcusgallolyticus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。其中菌株DLR 4-5-4与标准菌株Enterococcus faecium同源性为99%故被鉴定为屎肠球菌，其他45株菌与标准菌株同源性为100%。此外乳球菌的分离率远高于乳杆菌，乳球菌分离率为97.83%，其中肠球菌占71.74%，屎肠球菌占46.67%，马肠链球菌占19.56%。这可能是因为屎肠球菌是兼性厌氧的乳酸菌，和大多数乳酸菌一样，其耐酸耐高温等抗逆性能力差，但是对于严格厌氧、培养和保存条件苛刻的乳酸菌而言屎肠球菌更易于生长，同时大理地区气候温和，气候类型为低纬度高原季风气候，四季温差小[20-21]为屎肠球菌的生长提供了基础。

3.2 益生菌株的筛选结果

3.2.1 耐酸性能

用分离鉴定得到的46株菌在模拟胃液中进行耐酸性实验，实验结果如表4所示。

乳酸菌具有良好的耐酸性是保障其顺利进入胃肠道的先决条件。人体的胃部是一个高酸度的环境，pH值在1.5到4.0之间，成年人pH值约为2.0，在空腹条件下为1.5[7]，进食后胃液pH值被稀释，pH值上升至3.5左右[22]。食物通过胃的时间较短，一般为1～2 h，故选择在2 h后进行活菌数的测定[7]。由表4可知，46株分离纯化菌株在4个pH值下培养2 h后显示出不同的活菌数。46株菌在pH值为6.2的条件下活菌数均在105～106m L-1之间，说明菌株活力较好，适合进行耐酸实验。经过酸处理菌株DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2在pH值为3.5的条件下活菌数≥107m L-1；其中菌株 DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4在pH值为3.5和3的条件下活菌数≥107m L-1，这表明此4株菌具有更优的耐酸性，能在高浓度的胃液中存活并进入小肠。

表2 分离菌株的理化特性

表3 从乳饼样品中分离鉴定的乳酸菌

3.2.2 小肠耐受性

选取pH值在2.5～3.5条件下活菌数在105～106m L-1之间的12株菌模拟小肠液进行小肠耐受实验，结果如表5所示。

人体小肠中胆汁盐质量分数在0.03%～0.3%之间波动[23]，乳酸菌在小肠液中活菌数高则表明乳酸菌对小肠液有良好的耐受能力。常人进食后食物在小肠内停留的时间大致为6～8 h[24-25]，故选择在6 h后测定活菌数。由表5可知，0 h时12株菌的活菌数均≥105m L-1。6 h后在浓度为0.10%与0.15%的模拟小肠液中菌株DLR 3-2-4及DLR 6-12-2活菌数均≥107m L-1，此外在0.10%，0.1.5%，0.30%的小肠浓度中，菌株DLR 1-1-4，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 3-5-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2活力较好，活菌数均在105m L-1以上，这表明6株菌对模拟小肠液有良好的耐受性能在小肠内存活。

表4 乳酸菌对酸的耐受性

表5 乳酸菌对小肠耐受性

3.2.3 黏附性

选取模拟小肠液3个浓度下活菌数≥105m L-1的6株菌进行体外黏附实验。由于鼠李糖乳杆菌（LGG）黏附能力较强[26-27]，故用LGG作为对比，结果如表6所示。

表6 乳酸菌黏附细胞数 m L-1

乳酸菌能通过胃肠严苛的环境并能在小肠壁上黏附是乳酸菌定植和大量繁殖的前提,故乳酸菌在宿主细胞上黏附能力的强弱是衡量乳酸菌益身功能的重要标准之一。由表6可知，2 h后菌株DLR 6-12-2和LGG与细胞黏附的活菌数与0 h时比无显著差异，2 h后其他乳酸菌与细胞黏附的活菌数量与0 h时比差异显著。2 h后菌株DLR 6-12-2与细胞黏附的活菌数量与对比菌株LGG无显著差异；其他菌株与对比菌株LGG相比差异显著，其中菌株DLR 1-1-4和DLR 4-7-4与细胞黏附的活菌数量比LGG低，其他菌株与细胞黏附的活菌数量比LGG高。此外6株菌对人肠上皮细胞HT-29均表现出不同程度的黏附，DLR 1-1-4黏附率为 2.69%，低于其他菌株；菌株DLR 3-2-4，、DLR 4-7-4,DLR 6-12-2的黏附率较高，黏附率分别达到16.33%，15.72%,18.16%均高于LGG黏附率，这表明菌株DLR 3-2-4，，DLR 4-7-4,DLR 6-12-2能在胃肠道内定殖。

4 结论

6份大理羊乳饼样品中分离出的46株乳酸菌，通过16S r RNA基因序列对比，有3个属，6个种，其中屎肠球菌为优势菌。通过耐酸及耐小肠液实验从46株乳酸菌中筛选出6株对强酸及胆汁都具有良好的耐受性的乳酸菌，活菌数较高，能保证一定数量的菌体通过环境严苛的胃肠道；通过黏附性实验得到菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4黏附性优于参考菌株LGG。耐受性实验及黏附性实验表明菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DR 4-7-4不仅能通过胃肠道并能在胃肠道内定殖；因而菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4优良乳酸菌。

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