同位素特异肽段在乳清蛋白定量分析中的应用

王震,姚美伊，凌云，李晓娟，李奇峰，陈达

（1.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300071；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

0 引言

乳清蛋白的两种主要成分是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，对婴幼儿的睡眠及神经发育具有重要作用。传统的检测方法有毛细管电泳法[1]、十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳法[2]、高效液相色谱法[3]、反相高效液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]等，但因乳清蛋白在婴幼儿配方奶粉中存在变性的状态，传统方法无法测定总蛋白含量[6]。

Zhang等[7]研究表明α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特异肽段不受蛋白质变性状态的影响，可用于两种蛋白质的准确定量，α-乳白蛋白的特异肽段序列为VG INYW LAHK内标物序列为VGI*NYWL*AHK，β-乳球蛋白的特异肽段序列为IDALNENK及内标物为I*DAL*NENK。

因此本研究以两种蛋白的同位素特异肽作为内标，采用液相色谱—质谱联用法对两种蛋白进行了定量，并验证了方法的稳定性。

1 实 验

1.1 材料与试剂

甲酸、乙腈（色谱纯），实验用水为M illi-Q超纯水；标准品采用牛功能蛋白检测试剂盒包括α-乳白蛋白特异肽（2.0μm o l/L，分子量 1199.7 u）、β-乳球蛋白特异肽（4.0μm ol/L，分子量915.5 u）、α-乳白蛋白同位素特异肽（2.0μm ol/L，分子量 1214.4 u）、β-乳球蛋白同位素特异肽（4.0μm o l/L，分子量929.5 u）、α-乳白蛋白同位素标记内标（2.0μm o l/L，分子量2784.39 u）、β-乳球蛋白同位素内标（4.0μm o l/L，分子量3346.93 u）、牛胰蛋白酶溶液（500μg/m L）、碳酸氢铵（NH4HCO3）溶液（500 mm ol/L）、碘代乙酰胺（IAA）溶液（500 mm o l/L）、二硫苏糖醇（DTT）溶液（500 mm ol/L）、氯化钙（CaC l2）溶液（100 mm o l/L）。奶粉样品共13个（包括婴幼儿配方奶粉样品8个，用于配制婴幼儿配方奶粉的乳清蛋白原料3个，脱脂奶粉原料2个）。

1.2 仪器与设备

WA TERSACQU ITYTM超高效液相色谱仪，质谱仪QTRAP 5500，TRIPLE QUAD 4500，QTRAP4000，XE VOTM TQ，M S 6490；天平（PL203，感量0.01 g）；超声振荡器（KQ-500型）；涡旋混合器（VORTEX-QILINBEIER-5）；恒温水浴锅（B-491）,超纯水仪（Milli-Q公司）；容量瓶（100 m L，10 m L）；离心管（2 m L）；聚丙烯样品瓶（2009 p-1232-100，2 m L）；移液枪头（10，200，1 000μL）；移液管（10 m L）。

1.3方法

1.3.1 样品前处理

参照牛功能蛋白检测试剂盒（Realgoal HA15004）[6]。称取固体样品2 g(精确至0.01 g)于100 m L容量瓶中，用90 m L水将样品充分溶解，置于涡旋混合器或超声波震荡器中短时溶解，并用水定容至刻度。混匀后移取1.0 m L上述样品并用水定容至10 m L，再次混匀后准确移取200μL试样于2 m L离心管中，加入50 m L同位素内标中间混合液，150μL碳酸氢铵溶液、10μL DTT溶液，混匀后置于75℃恒温水浴30m in；冷却至室温，加入30μL的IAA溶液，暗处静置30m in；再加入10μL的CaC l2溶液、50μL牛胰蛋白酶溶液、充分混匀后置于37℃恒温水浴锅中酶解5 h，用10μL甲酸混匀，室温下静置15 m in，加入490μL水，涡旋混匀。供液相色谱串联质谱仪检测。

1.3.2 仪器工作条件

色谱条件：色谱柱 ACQU ILTY UPLC Peptide BEH C 18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，流动相A为0.1%甲酸-水，B为0.1%甲酸-乙腈；柱温40℃；进样量5.0μL；梯度洗脱：0～0.8m in,5%B,0.8～1.2m in,5%～10%B,1.2～2.5 m in,10%～17%B,2.5～2.6 m in,17%～23%B,2.6～3.8m in,23%B,3.8～4.0 m in,23%～100%B,4.0～4.8 m in,100%B,4.8～5.0m in,100%～5%B,5.0～5.7m in 5%B。

质谱条件(AB5500)：电喷雾电离源,正离子模式,多反应监测，气帘气:40雾化气:40,辅助气:50,电喷雾电压:5500,去溶剂温度:450。

1.3.3 标准曲线的绘制

配置α-乳白蛋白特异肽段浓度为：5，25，75，150，300，500 nm ol/L；内标法添加α-乳白蛋白同位素特异肽段浓度为100 nm o l/L。配置β-乳球蛋白特异肽段浓度为：10，50，150，300，600，1 000 nm o l/L；内标法添加β-乳球蛋白同位素特异肽段的浓度为200 nm ol/L。

1.3.4 方法的实验室内重复性

分别在5个实验室采用5种不同的液相色谱串联质谱仪开展实验室内的日内及日间重复性试验，对同一种奶粉进行每天六次平行测定实验，连续测定3 d，并按照公式（1）计算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的质量浓度：

式中：X：为试样中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的质量分数；ρ为根据标准曲线计算得到的试样酶解液中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的质量浓度；V为试样的定容体积；m为试样质量；f1为待测试样溶液的稀释倍数；10-4为将质量浓度单位μg/m L换算为m g/m L的换算系数。

1.3.5 方法的实验室间再现性

按照前处理方法，分别在5个实验室分别测试13种奶粉样品，每个样品平行测定两次，根据公式（1）计算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的质量浓度，然后计算每个样品测试结果计算相对标准偏差（RSD）和再现性限（R），考察方法针对不同样品的实验室间再现性。

2 结果与讨论

2.1 同位素特异肽在5种不同质谱仪上的质荷比优化结果

α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的特异肽段及同位素特异肽段的质谱信息如表1～表5所示。在5种不同质谱仪器上蛋白质的质荷比的差异小于0.2,但离子信号强度有所差异，如质谱仪QTRAP 5500产生的子离子355.3的信号强度要高于子离子284.3的强度，而在其他几台质谱仪器上子离子284.3的信号强度更高，可根据不同仪器选取定量离子对。

表1 质谱仪型号为QTRAP 5500，AB SCIEX的MRM质谱参数

表2 质谱仪型号为TR IPLEQUAD4500,ABSCIEX的MRM质谱参数

2.2 离子流图

在QTRAP5500 AB仪器上，利用ESI+模式对α-乳白蛋白特异肽、β-乳球蛋白特异肽及两种同位素内标的离子流图进行了监测，结果如图1所示。因α-乳白蛋白特异肽、β-乳球蛋白特异肽及其内标因具有相同的分子结构，因此在色谱保留时间上具有一致性，两组蛋白的保留时间分别是4.02 m in和2.76 m in。但可通过内标物与特异肽的质量数对两者进行区分。

表3 质谱仪型号为QTRAP4000,AB SCIEX的MRM质谱参数

表4 质谱仪型号为XEVOTM TQ,WATERS的MRM质谱参数

表5 质谱仪型号为MS6490,Agilent的MRM质谱参数

图1 多级监测离子流

2.3 线性关系

内标法采用特异肽的面积与同位素特异肽峰面积比值作为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，得到α-乳白蛋白特异肽的回归方程y=0.00768x-0.0297,R2=0.9954.得到β-乳球蛋白特异肽段的回归方程y=0.00578x-0.0202,R2=0.9974.表明两种蛋白质均具有良好的线性关系，可用于定量分析。

2.4 方法的实验室内重复性

表6列出了5个不同实验室开展实验室内的实验室内日内及日间重复性考察结果，α-乳白蛋白的日内RSD在1.23%～10.1%之间，日间RSD在4.13%～12.2%之间；β-乳球蛋白日内RSD在1.06%～10.3%之间，日间RSD在1.52%～12.0%之间。

2.5 方法的实验室间再现性

表7和表8为所有样品（共13个，包括婴幼儿配方奶粉样品8个，用于配制婴幼儿配方奶粉的乳清蛋白原料3个，脱脂奶粉原料2个）在5种仪器上的测定结果。表7和表8中，每个样品测试结果计算再现性限（R），考察方法针对不同样品的实验室间再现性，结果表明，对于α-乳白蛋白，RSD在10.4%～18.4%之间。平均测定值小于1.0%的5个样品，再现性限（R）在0.19～0.44之间，平均测定值在1.0%～2.0%的6个样品，再现性限（R）在0.49～0.77之间，对于α-乳白蛋白含量较高的2个样品，平均测定值分别为9.71%和30.2%，再现性限（R）分别为3.58和16.7。对于β-乳球蛋白，RSD在10.7%～23.6%之间。其中1个含量较低的样品，平均测定值为1.34%时，再现性限（R）为0.71，平均值在2.85%～3.89%的8个样品，再现性限（R）在1.03～2.36之间，对于质量分数较高的3个样品，平均测定值分别为6.38%，15.9%，34.1%；再现性限（R）分别为3.50，9.51，20.5。

3 结 论

本研究建立了一种测定婴幼儿奶粉中变性及非变性的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白总量的高效液相色谱-串联质谱法，此方法采用同位素特异肽作为内标物，利用C 18色谱柱对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特异肽进行了分离，两种蛋白的线性关系良好可以进行定量测定，实验室内重复性标准偏差在1.06%～12.2%，实验室间再现性标准偏差为10.4%～23.6%。传统方法只能测定非变性的乳清蛋白成分，本研究弥补了这一不足之处，提供了一种准确测定总乳清蛋白成分的方法，并在不同液相质谱仪器上进行了应用，为婴幼儿奶粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的检测提供方法参考。

表6 方法的重复性考察%

表7 α-乳白蛋白测定的实验室间再现性考察结果 %

表8 β-乳球蛋白测定的实验室间再现性考察结果 %

参考文献:

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[5]张京顺.乳与乳制品中主要乳清蛋白组分的定量分析检测方法研究[D].浙江大学,2012.

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