发酵豆制品中蜡样芽孢杆菌的调查分析

刘 琪，陈 静，张佩娜，朱蔚姗，蒋立文

（食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128）

蜡样芽孢杆菌是一种能在极端的环境条件下生存的革兰氏阳性杆状芽孢菌，大小为（1～1.3）×（3～5）μm，兼性需氧，芽孢不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似[1]。它一般被认为是污染物，当数量达到一定级别也会引起重大疾病[2]。通常，当其在食物中的含量超过1×105CFU/g·mL时就有可能造成食物中毒[3]。蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒大多因食用剩饭、剩菜、乳制品等富含碳水化合物的食品[4]。芽胞具有耐热性，短暂的热处理会诱发芽胞的萌发，大量生长繁殖，产生毒素并引发食物中毒[5]。根据2008—2010年我国突发公共卫生事件报告管理信息系统统计，我国细菌性食物中毒事件中，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒在发生起数和发病人数方面均居前3位[6]。周彦伶等人在研究一起蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒中发现致病食品中蜡样芽孢杆菌的菌落总数大于1×106CFU/g。而蜡样芽孢杆菌在发酵豆制品中的安全隐患也已经引起了广泛关注，其中尤以豆豉、腐乳[7]被研究较多。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

在超市中根据产品特点和区域加工差异性进行样品的采集，以确保样品的代表性。采集的样品有3种类型，即豆豉、豆酱和腐乳。

样品信息见表1。

1.1.2 试剂

甘露醇卵黄多黏菌素琼脂基础（MYP）、营养琼脂，广东环凯微生物科技有限公司提供；50%卵黄乳液，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供；多黏菌素B（MYP及胰酪胨大豆多黏菌素B肉汤配套试剂），广东环凯微生物科技有限公司提供。

蜡样芽孢杆菌生化鉴定盒（葡萄糖（厌氧）、3%过氧化氢溶液、半固体琼脂、硝酸盐（还原）、溶菌酶营养肉汤、质控营养肉汤、甘露醇、葡萄糖磷酸盐胨水（VP）、蛋白质毒素结晶体染色液），广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要仪器与设备

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产品；LRH-250型智能生化培养箱，上海飞越实验仪器有限公司产品；SW-CJ-1F型净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；ZWY-210型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司产品。

表1 样品信息

表2 蜡样芽孢杆菌鉴定说明

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理方法

称取每种样品各25 g，分别放入225 mL装有适当玻璃珠的无菌生理盐水中，然后放入摇床中振摇30 min，再进行10倍系列稀释，最后取2～3个适宜稀释度进行接种培养。

1.2.2 蜡样芽孢杆菌疑似菌的检测

参照GB 4789.14—2014，每个稀释度分别取0.3，0.3，0.4 mL接种到3个MYP琼脂平板上，在30±1℃培养24～48 h，计数典型菌落数。

1.2.3 蜡样芽孢杆菌的生化鉴定

对挑选出的蜡样芽孢杆菌典型菌落进行纯培养，并参照表2进行生化鉴定，再对照表3进行判定。

蜡样芽孢杆菌鉴定说明见表2，蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别见表3。

1.3 数据处理

1.3.1 确认并计数典型菌落

选择培养出了蜡样芽孢杆菌典型菌落（粉红色，周围有粉红色的晕）的平板，且同一稀释度3个平板的菌落总数之和在20～200 CFU，计数典型菌落数。

1.3.2 计算公式

根据平板上不同的菌落数情况，选择不同的计算公式。

表3 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别

式中：T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；

A——某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落总数；

B——鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；

C——用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；

d——稀释因子。

式中：T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；

A1——第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；

A3——第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；

B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；

B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；

C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；

C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；

1.1 ——计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；

d——稀释因子（第一稀释度）。

1.3.3 数据统计

使用Excel 2010进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品中蜡样芽孢杆菌疑似菌检测与分析

样品中蜡样芽孢杆菌疑似菌检出情况见表4。

根据GB 4789.14—2014所确定的检测标准，以甘露醇卵黄多黏菌素琼脂为培养基进行选择培养，对采自市场上的13个发酵豆制品进行蜡样芽孢杆菌疑似菌检测，检测结果如上表所示，不同种类、不同地区、不同生产工艺的发酵豆制品中蜡样芽孢杆菌疑似菌普遍存在。几类发酵豆制品中均检出了蜡样芽孢杆菌，总检出率为84.6%，其中腐乳和豆豉样品全部检出，而豆酱只有一个样品检出。发酵豆制品是我国传统的酿造产品，因其原料不同、产地不同、气候条件存在差异，且参与发酵的微生物区系种类复杂等，产品的微生物控制难以达到标准化。腐乳生产工艺没有杀菌处理过程，故成品受蜡样芽孢杆菌及其他杂菌污染的几率较高。豆豉后期有炒制过程，但仍均检出了蜡样芽孢杆菌，可能是炒制温度不够或者炒制时间不够。豆酱尽管产品的含水量较高但一般产品保质期较长（长的有24个月），生产过程中进行了熬制和后期杀菌处理，微生物检出率相对腐乳、豆豉要低，这种差异与产品加工工艺和产品品质差异有关。

表4 样品中蜡样芽孢杆菌疑似菌检出情况

2.2 蜡样芽孢杆菌的鉴定与数量分析

样品中蜡样芽孢杆菌数见表5。

表5 样品中蜡样芽孢杆菌数

我国发酵豆制品的相关标准中并没有明确规定蜡样芽孢杆菌的残留限量，但香港地区食品中蜡样芽孢杆菌可接受临界值为1×105CFU/g·mL，因此我国大多是以此临界值为参考，当摄入的食品中此菌含量大于1×105CFU/g·mL时，就可能引起食物中毒。试验腐乳样品中蜡样芽孢杆菌数大于1×105CFU/g的概率为20%。蜡样芽孢杆菌风险因子较高的为干型腐乳。从配料方面来看，干型腐乳中未加入白酒。腐乳生产工艺没有杀菌过程，对微生物的抑制作用主要靠高盐和高酒精作用，而干腐乳中没有加白酒，故其对微生物的抑制作用相比其他类型的腐乳来说较弱，受杂菌污染的可能性更大。白方腐乳不加油，结果显示蜡样芽孢杆菌数较少，这与白方腐乳生产企业控制要求要高有关。而加入食用油的腐乳中此菌数量比白方腐乳多，但比干型腐乳少，这可能与加工中热油较好地将产品空气排除且工艺相对粗放有关。豆酱成品经灌装杀菌后蜡样芽孢杆菌检出率一般较低，但试验中样品6检出了此菌且含量大于可接受临界值，可能是加工过程中杀菌不彻底或是在运输销售过程中受到外界杂菌污染。所测豆豉样品均经高温炒制，炒制过程能起到良好的杀菌作用。但豆豉样品中所测出的蜡样芽孢杆菌数仍有1×102～1×105CFU/g，数量较多，由此可见，豆豉制作中高温炒制时间和温度需要有保障。

3 结论

蜡样芽孢杆菌是条件致病菌，广泛分布于自然界中，食品中蜡样芽孢杆菌的来源主要是外界污染[8]。在本次调查中发现，豆制品中普遍存在蜡样芽孢杆菌，检出率较高，其中豆豉、腐乳中蜡样芽孢杆菌数大多偏高。与其他学者的研究结果比较相符。如周婷婷[9]在豆制品样品中发现腐乳中蜡样芽孢杆菌检出率84.2%。不过已有研究表明蜡样芽孢杆菌在加工过程中可通过加入辅料等方式对其进行控制。如穆可云[10]发现大蒜提取物对腐乳中的蜡样芽孢杆菌有抑制作用，但这些控制措施并不完善。建议加强豆制品中蜡样芽孢杆菌的检测，并制定相应的限量标准，与国际接轨，降低食物中毒风险。

参考文献：

[1]刘斌.食品微生物检验 [M].北京：中国轻工业出版社，2016：271-275.

[2]S Tusgul，G Prod'hom，L Senn， et al.Bacillus cereus bacteraemia： comparison between haematologic and nonhaematologic patients[J].New Microbes and New Infections，2017，15 （3）：65-71.

[3]周婷婷，易敏英，相大鹏，等.白腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的污染及防治 [J].中国酿造，2014，33（5）：77-80.

[4]谢来球，瞿丽开.136例蜡样芽孢杆菌食物中毒案例分析[J].食品安全导刊，2017（6）：31-34.

[5]蒋荣荣，刘晓云，陈雅蘅，等.豆豉中蜡样芽孢杆菌污染情况分析 [J].中国酿造，2013，32（3）：67-69.

[6]褚发军，冉陆，马莉，等.2008—2010年全国突发公共卫生事件网络报告食物中毒流行病学分析 [J].中国食品卫生杂志，2012，24（4）：387-390.

[7]廖文生.腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌污染风险评估和控制措施 [J].检验检疫学刊，2015，25（5）：46-48.

[8]王为民，王燕萍.1起蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒调查报告 [J].中国校医，2016，30（11）：832，834.

[9]周婷婷.蜡样芽孢杆菌在腐乳中的污染状况及其控制方法研究 [D].广州：华南理工大学，2013.

[10]穆可云.大蒜提取物对蜡样芽孢杆菌的抑制研究 [D].广州：华南理工大学，2013.◇