黄葵胶囊对慢性肾小球肾炎模型大鼠肾组织病理和免疫功能的影响

徐赛华 胡静娜

慢性肾脏病指肾脏系统代谢紊乱导致的肾脏结构性破坏和功能性损害综合征，发病机制复杂，可能与免疫紊乱有关[1]。慢性肾小球肾炎发病率较高，西医治疗多用糖皮质激素和免疫抑制剂，虽有较好的临床疗效，但长期服用药物副作用较大[2]。中医认为慢性肾小球肾炎是由于风邪夹湿引起湿浊、瘀血，中医药在防治中具有独特的优势[3]。具有“清热除湿、消肿解毒”功效的黄葵胶囊对慢性肾小球肾炎具有较好的临床疗效。本研究旨在探讨黄葵胶囊对慢性肾小球肾炎大鼠肾组织免疫功能和炎症因子的影响，为其治疗提供依据。

1 实验材料

1.1动 物 健康雄性SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，8周龄，体质量190±10g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证号：SCXK（京）2011-0011。饲养于浙江中医药大学动物实验中心。

1.2药物与试剂 黄葵胶囊（规格：0.5g/粒，江苏苏中药业集团股份有限公司，批号20160123）；小牛血清白蛋白、不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂购自上海生工生物工程有限公司（批号16010627、16010556、16010581）；RIPA裂解试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（批号N16021766、p160102-1）；白介素-6（IL-6）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）试剂盒购自南京建成生物工程研究所公司（批号20160213、20160225、20160209）；大鼠 PITC CD3、PE CD4和CD8抗体购自美国eBioscience公司（批号D160312、D160328、D160407）。

1.3仪 器 OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪，日本奥林巴斯有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，苏州安泰超净工作台净化有限公司；SMZ660荧光显微镜，日本尼康公司；23R离心机，力康集团力新仪器（上海）有限公司；DXI800化学发光仪，美国贝克曼库尔特有限公司产品；FACSCanto流式细胞仪，美国BD公司等。

2 实验方法

2.1慢性肾小球肾炎大鼠模型建立[4-5]SD大鼠适应性喂养1周，禁食不禁水12h后，取40只大鼠建立慢性肾小球肾炎模型。将适量小牛血清白蛋白溶于 0.01mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.2～7.4）中，浓度为2mg/mL，与等体积不完全弗氏佐剂混成乳白色悬液，在大鼠双侧腋下、腹股沟作5点皮下注射，2mL/只。注射1周后，将溶有小牛血清白蛋白的磷酸缓冲液与等体积的完全弗氏佐剂混匀成浓度为1mg/mL的乳白色悬液，相同方式皮下注射。第3周取浓度为2mg/mL的小牛血清白蛋白的磷酸缓冲液1mL/只，进行大鼠尾静脉注射，建立慢性肾小球肾炎大鼠模型。

2.2实验分组和给药 将50只SD大鼠按照性别分为两个区组并编号，采用随机数字表法分为模型组、黄葵胶囊低、中、高剂量组及空白对照组，每组10只。除空白对照组外其余大鼠均造模。建模2周后空白对照组和模型组给予2mL/（kg·d）生理盐水灌胃，黄葵胶囊低、中、高剂量组分别给予0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg的黄葵胶囊灌胃，体积为2mL/（kg·d）。连续灌胃8周后处死各组大鼠，收集肾脏组织、尿液和血清样本进行检查。

2.3指标测定

2.3.1病理学观察 取各组大鼠左侧部分肾组织，10%甲醛固定，常规石蜡切片包埋，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理学变化。

2.3.2肾功能指标检测 取各组大鼠主动脉血3mL，置不含抗凝剂的试管内，室温下自然凝集30min，2000r/min离心10min，分离血清，全自动生化分析仪分析肾功能指标血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）含量。

2.3.3外周血T淋巴细胞亚群比例检测 取各组大鼠眼眶静脉血至流式管中，分别加10μL入CD3、CD4和CD8单抗和50μL EDTA抗凝血，混合均匀，避光孵育20min，每管加入2mL溶血素，避光孵育20min，2000r/min离心10min，弃去上清，每管2mL PBS混匀，离心弃去上清，重复洗涤2次，弃上清，加2mL PBS重悬混匀后流式分析外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8比例。

2.3.4肾组织炎症因子检测 取各组大鼠右侧肾脏组织样本，经RIPA裂解后，4℃以10 000r/min离心10min，BCA蛋白定量试剂盒在590nm处检测蛋白浓度，进行SDS电泳，采用蛋白质印迹法检测肾脏组织IL-6、ICAM-1和TGF-β1水平，严格按照试剂盒说明书操作，计算光密度值。

2.4统计学方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料用（x±s） 表示，组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠肾脏病理组织学比较 空白对照组大鼠肾小球、系膜基质未见明显病理变化，模型组大鼠肾小球硬化、系膜基质增生，黄葵胶囊低、中、高剂量组大鼠肾脏病理变化均较模型组明显减轻，呈剂量依赖性，但黄葵胶囊高剂量组大鼠肾脏病理变化仍较空白对照组严重。见图1（封二）。

3.2各组大鼠肾功能指标比较 模型组大鼠血清Scr、BUN和UA含量均高于空白对照组、黄葵胶囊低、中、高剂量组（P＜0.05），上述指标随黄葵胶囊剂量的增加含量降低。见表1。

表1 各组大鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）含量比较（x±s）

3.3各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群比例比较 模型组大鼠外周血CD3、CD4和CD4/CD8均明显低于空白对照组和黄葵胶囊低、中、高剂量组，CD8高于空白对照组和黄葵胶囊低、中、高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

3.4各组大鼠肾组织炎症因子水平比较 模型组大鼠肾组织IL-6、ICAM-1和TGF-β1水平均高于空白对照组，且明显高于黄葵胶囊低、中、高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表2 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8比例比较（%，x±s）

表3 各组大鼠肾组织IL-6、ICAM-1、TGF-β1水平比较（光密度值，x±s）

4 讨论

慢性肾小球肾炎病因复杂，是由多种病理类型组成的肾小球进行性肾功能衰退疾病，是导致肾功能衰竭的主要原因[6]。慢性肾小球肾炎外周血T淋巴细胞亚群紊乱，细胞炎症因子表达升高，导致免疫功能紊乱，以及内皮细胞和巨噬细胞表达异常，进一步加剧其损伤程度[7]。ICAM-1受到炎性因子刺激后，可增强巨噬细胞与血管内皮细胞间黏附，引起器官结构和功能损伤，激活肾脏局部的肾素-血管紧张素系统，促进TGF-β1表达，加速肾病进展。慢性肾小球肾炎的药物防治以激素和免疫抑制剂为主，长期应用可导致多种副作用，对患者造成二次伤害[8-9]。黄葵胶囊联合激素或免疫抑制剂，对慢性肾炎具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不明确。

本研究发现，黄葵胶囊可保护慢性肾小球肾炎大鼠肾脏组织，降低大鼠血清Scr、BUN和UA含量，减轻肾组织IL-6、ICAM-1和TGF-β1炎症水平，稳定外周血T淋巴细胞CD3、CD4和CD8亚群比例。药理研究[10]表明，黄葵胶囊主要成分为植物黄蜀葵黄酮类化合物，具有抗感染消除、消除尿蛋白、抵抗血小板、增厚肾小球系膜、抗氧化、抑制肾小球免疫炎症反应、保护肾功能等作用。黄葵胶囊通过增加毛细血管通透性，消除机体过度自由基，减轻机体水肿，减轻肾小管间质病变，改善机体微炎症状态和T淋巴细胞亚群紊乱状态，减轻炎症反应和保护肾功能，且黄葵胶囊的作用呈剂量依赖性[11-12]。本研究提示黄葵胶囊可保护慢性肾小球肾炎大鼠肾脏组织，改善肾功能指标，减轻炎症反应，改善免疫功能。

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