植物酵素发酵过程中理化成分变化规律及其对果蝇寿命的影响

邵颖，陈安徽，陈尚龙，巫永华，赵文静，贺程，黄勃，夏振荣，王西朴

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州 221111）（2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，徐州工程学院，江苏徐州 221111）（3.江苏康能生物工程股份有限公司，江苏仪征 221100）（4.江苏君乐宝乳业有限公司，江苏徐州 221700）

植物酵素又称酶、植物发酵液，是新鲜蔬菜、水果、食用菌和药食同源植物等原料在益生菌的作用下发酵产生的一类天然的具有营养保健功效的发酵制品[1,2]。作为生物体产生的具有催化作用的生物大分子，酵素参与人体各种代谢过程[3,4]。研究表明，酵素中含有丰富的维生素、氨基酸、酚类、黄酮、矿物质、功能性低聚糖和功效酶等多种功能成分[5～7]，部分研究报道也提示了酵素在消炎、抗衰、抑菌、优化体内环境、抗癌、提高机体免疫、修复机体损伤等方面的生物活性[8～12]。

酵素及酵素食品长期以来风靡于日韩、台湾及欧美发达国家，我国的酵素及其制品的生产尚处于初期发展阶段，存在着产品质量不稳定等制约其规模化发展的问题[13,14]。目前，针对酵素的研究亦引起了较为普遍的关注，在酵素的发酵生产、产品开发及酵素和酵素制品的营养学领域的研究均有相关报道。酵素发酵原料在发酵过程中会发生特定的生物化学反应，使酵素不同发酵阶段的理化指标发生变化。为了全面探讨酵素的发酵过程，本实验研究了酵素发酵过程中pH值、还原糖、总多酚、总酸及体外抗氧化活性的动态变化，并且为了验证酵素的抗氧化活性及抗衰延寿功能，实验还以黑腹果蝇为实验对象按照不同剂量将植物酵素添加到果蝇基础培养基，以仅以基础培养基饲喂的果蝇为对照，通过测定果蝇寿命及其体内 SOD酶活力和MDA含量评价植物酵素的延寿抗衰效果。研究的进行可以为植物酵素人工发酵工艺的优化及酵素在抗氧化、延寿方面保健功效的确定提供实验证据，同时为酵素在保健品、保健食品和化妆品等领域的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

植物酵素：由徐州工程学院发酵工程实验室自行发酵。

实验动物：果蝇(Drosophila melanogaster)，野生型，由安徽农业大学生命科学学院提供。

化学试剂：95%乙醇，宜兴市第二化学试剂厂；考马斯亮蓝、冰乙酸，天津市福晨化学试剂厂；苯甲酸，天津市基准化学试剂厂；SOD试剂盒、MDA试剂盒，南京建成生物工程公司。

果蝇基础饲料：玉米粉10%，红糖5%，酵母粉2%，琼脂1.5%，苯甲酸0.15～0.4%。

1.1.2 仪器与设备

真空冷冻干燥机 LGJ-10，上海比朗仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器YXQ.SG4.280，上海华线医用核子仪器有限公司；电热鼓风干燥箱DHG-9053A，上海益恒实验仪器有限公司；恒温水浴锅，国华电器有限公司；梅特勒电子天平AE200型，上海分析仪器厂；KQ3200E超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；UV2802PC紫外-可见光分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物酵素的发酵

将48种新鲜蔬菜、水果、菇类等洗净切碎后榨汁，去除滤渣后按照与滤液质量比 1：1的比例加入白砂糖，向滤汁中按照5%的比例接入酵母菌并于25 ℃条件下静置发酵5 d，然后接入10%醋酸菌于28 ℃条件下发酵7 d，最后接入5%乳酸菌于37 ℃条件下发酵5 d，之后转入25 ℃条件后熟存放至第70 d后常温保存。发酵液经膜过滤、脱醇及巴氏杀菌处理后即得植物酵素。另外，自果蔬发酵之日开始每7 d测定一次发酵液的pH值、还原糖、总酚、黄酮、总酸的含量及DPPH自由基清除活性和还原力。

1.2.2 pH测定

使用pH计直接测定。

1.2.3 植物酵素理化指标的测定

1.2.3.1 还原糖含量的测定

采用3,5-二硝基水杨酸法[15]。

1.2.3.2 总酸含量测定

采用酸碱滴定法测定[16]。

1.2.3.3 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu比色法(FC法)，以没食子酸为标准品测定总酚含量[17]。实验中绘制的标准曲线回归方程为y=14.654x+0.0254，R2=0.9953，线性关系良好。样品中总酚含量以毫升样品的没食子酸当量(mg)表示。

1.2.4 植物酵素体外抗氧化活性测定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

参照邵颖等[18]的方法进行。

1.2.4.2 还原力的测定

参照邵颖等[19]的方法进行。

1.2.5 植物酵素对果蝇寿命的影响[20]

将植物酵素分别按照 0.5%、1%、2%（V/V）的比例添加到果蝇基础培养基，并将在此种培养基中饲喂的果蝇设置为实验组，以基础培养基饲喂的果蝇为对照组（CK）。选取8 h内孵化的果蝇，乙醚麻醉并鉴定性别后选取大小均一的个体于斜面试管中进行饲喂，每只试管放10只果蝇，每个样品雌、雄果蝇各设置3个重复。将各组果蝇置于25 ℃恒温培养箱中培养，每日观察并记录果蝇的存活情况，统计果蝇半数死亡时间、最高寿命和平均寿命。

1.2.6 植物酵素对果蝇体内SOD活性和MDA含量的影响

1.2.6.1 果蝇组织匀浆的制备

将植物酵素分别按照 0.5%、1%、2%（V/V）的比例添加到果蝇基础培养基中，将在此培养基中饲喂的果蝇设置为实验组，以不添加酵素仅以基础培养基饲喂的果蝇为对照组（CK）。选取8 h内孵化的果蝇，乙醚麻醉并鉴定性别后选取大小均一的个体于斜面试管中饲喂，每只试管放10只果蝇，每个样品雌、雄果蝇各设置3个重复。将各组果蝇置于25 ℃恒温培养箱中培养 20 d后准确称量每只试管中果蝇的重量，用0.15 mol/L的生理盐水充分研磨后配制成1%（m/V）的组织匀浆并于6000 r/min离心10 min取上清液备用。

1.2.6.2 果蝇组织中可溶性蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。取 1%果蝇组织匀浆液经适当稀释后于595 nm测定吸光值，每组设置3个重复，根据标准蛋白回归方程计算蛋白质含量。

标准蛋白质标准曲线回归方程为y=0.0005x+0.0252，R2=0.9907。

1.2.6.3 果蝇体内SOD活力的测定

按照试剂盒使用说明操作。取50 μL果蝇组织匀浆测定SOD活力，每组设置3个重复。按照下列公式（1）计算SOD活力。

1.2.6.4 果蝇体内MDA含量的测定

按照试剂盒使用说明操作。取100 μL果蝇组织匀浆测定MDA含量，每组设置3个重复。按照下列公式（2）计算MDA含量。

1.2.7 实验数据统计分析

实验数据采用DPS7.05处理软件进行分析，实验每组平行3次，实验结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 植物酵素发酵过程中pH的变化

图1 植物酵素发酵过程中pH值的变化Fig.1 Changes in pH value during fermentation of plant ferment

酵素发酵过程中pH值的动态变化如图1所示。由图1可知，复合果蔬在发酵第7 d时发酵液的pH值为4.12，随着发酵的进行，pH值呈下降趋势，在发酵至14 d时降低到3.78，在第49 d时降低到3.53，随后虽有小幅度的增加，但始终保持在3.56左右，最后在第70 d时降低到3.50。发酵过程中pH值能在较短时间内降低到4以下，可以控制大多数有害微生物特别是霉菌的生长，保障了发酵过程的产品安全。

2.2 植物酵素发酵过程中理化指标的变化

2.2.1 酵素发酵过程中还原糖含量的变化

还原糖含量在酵素发酵过程中的动态变化如图 2所示。酵素的生产原料是富含果糖的水果和蔬菜，所以在发酵初期因为生产原料中果糖的存在使得还原糖的含量较高，但随着发酵的进行，接入的酵母菌首先利用单糖使得还原糖含量逐渐降低。但在发酵的第14～21 d又出现了还原糖含量激增的现象，考虑可能是在酵素生产中白砂糖按照与果蔬同等的比例添加，同时果蔬中的可溶性纤维被微生物生长代谢过程中分泌的一些胞外酶水解而转化为葡萄糖、果糖等还原糖。

随后在第21 d之后还原糖被微生物吸收利用，含量呈现连续的下降趋势，在发酵终点降低到78.78±3.24 mg/mL。

图2 植物酵素发酵过程中还原糖含量的变化Fig.2 Changes of the reducing sugar content during fermentation of plant ferment

2.2.2 酵素发酵过程中总酸含量的变化

图3 植物酵素发酵过程中总酸含量的变化Fig.3 Changes of total acid content during fermentation of plant ferment

酵素发酵原料水果及蔬菜自身含有大量的有机酸，发酵过程中酵母菌、乳酸菌等的代谢又会产生有机酸类的代谢产物，所以在酵素中含有种类多样、含量丰富的有机酸。实验中测定了发酵液中总酸含量在发酵过程的变化。结果如图3所示。

由图3可知，发酵液中总酸含量在发酵过程中逐渐增加，在发酵的第7至第14 d的时间内总酸含量增加幅度较后期大，总酸含量的增加会使发酵液的 pH值降低，所以发酵过程中pH值不断下降，与pH值在发酵过程中的变化相对应。

2.2.3 酵素发酵过程中总多酚含量的变化

多酚类化合物因为存在于植物组织中，且具有抗菌、消炎和抗氧化等生理功能，所以在以植物为原料的酵素的发酵过程中测定了发酵液中多酚的动态变化。由图4可知，多酚的含量随着发酵的进行而增加，在发酵终点达到55.04±1.36 μg/mL。酵素发酵过程中总多酚含量增加应该是微生物代谢作用于植物细胞，细胞破壁后胞内多酚释放入发酵液所致。

图4 植物酵素发酵过程中总多酚含量的变化Fig.4 Changes of the total polyphenol content during fermentation of plant ferment

2.3 植物酵素发酵过程中体外抗氧化能力的变化

2.3.1 酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

图5 植物酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化Fig.5 Changes of DPPH free radicals scavenging ability of plant fermentduring fermentation

酵素发酵过程中测定了酵素的DPPH自由基清除能力，实验中酵素原液被稀释20倍后测定了酵素稀释液的自由基清除能力，具体的DPPH自由基清除能力的动态变化结果如图5所示。

由图5可知，酵素的DPPH自由基清除能力随着发酵的进行而不断增加，在发酵至第21 d时清除率已超过90%，在第42 d时达到96.5±0.58%，随后缓慢增长至发酵终点的 97.71±1.44%，比发酵初期的77.64±0.66%高出 25.85%，说明微生物的发酵作用可提高果蔬汁的DPPH自由基清除能力，酵素具有一定的抗氧化功效。

2.3.2 酵素发酵过程中还原力的变化

还原力是检测物质体外抗氧化活性的一个重要指标，实验过程中同样将酵素原液稀释20倍，通过测定酵素稀释液的还原能力反映酵素的抗氧化活性。具体实验结果如图6所示。

图6 植物酵素发酵过程中还原力的变化Fig.6 Changes of reducing power during fermentation of plant ferment

由图6可以看出，随着发酵的进行酵素的还原能力亦不断增加，在发酵至第35 d时酵素20倍稀释液的吸光值即达到了1.13，随后基本趋于平稳。酵素发酵过程中还原力的变化趋势与其DPPH自由基清除能力的变化趋势相似。说明发酵过程同样有效提高了酵素的还原能力。

2.4 植物酵素对果蝇寿命的影响

以在果蝇基础培养基中按照0.5%、1%和2%的比例添加植物酵素饲喂的果蝇作为实验组，以基础培养基饲喂的果蝇为对照组，按照1.2.2的方法评价了植物酵素对果蝇寿命的影响。具体的实验结果如表1所示。由表1的结果可知，与对照组比较，在果蝇基础培养基中添加 2%剂量的植物酵素可以显著提高雄果蝇的半数死亡时间、平均寿命和最高平均寿命（p＜0.05），分别比对照组提高了22.06%、15.44%和14.99%；

对于雌性果蝇而言，基础饲料中添加 2%的酵素同样显著提高了半数死亡时间和平均最高寿命（p＜0.05），分别比对照组提高了16.84%和21.19%，2%剂量酵素的添加虽然也提高了雌果蝇的平均寿命，但并未达到显著水平。另外，1%剂量组雌果蝇的平均最高寿命也显著高于对照组和0.5%剂量组。说明在果蝇培养基中添加 2%剂量的植物酵素对于延长果蝇寿命具有显著效果。

表1 植物酵素对果蝇寿命的影响Table 1 Effects of plant ferment on the lifespan of Drosophila Melanogaster

表2 植物酵素对果蝇SOD活力和MDA含量的影响Table 2 Effects of plant ferment on SOD activity and MDA content of Drosophila Melanogaster

2.5 植物酵素对果蝇体内 SOD活力和 MDA含量的影响

以果蝇基础培养基饲喂的果蝇为对照，将在分别添加了0.5%、1%和2%植物酵素的培养基中饲喂20 d的果蝇制成1%组织匀浆液，按照1.2.3.3的方法测定SOD活力，按照1.2.3.4的方法测定MDA含量。测定结果如表2所示。由表2可知，植物酵素在果蝇基础培养基中的添加均提高了雌、雄果蝇的 SOD活力，与对照组相比，2%添加剂量的提高效果达到显著水平（p＜0.05），分别提高了5.98%和7.50%；植物酵素在果蝇基础培养基中的添加同样降低了果蝇体内 MDA的含量，对于雌果蝇来说，1%和2%剂量组分别比对照组显著降低了23.13%和32.09%（p＜0.05），而各剂量组雄果蝇体内 MDA的含量均显著低于对照组（p＜0.05）。说明植物酵素具有显著的体内抗氧化活性，抗衰效果明显。

3 结论与讨论

3.1 植物酵素作为一种功能性微生物发酵制品因其显著的功效多年来盛行于欧美、东南亚、日本以及台湾地区，酵素的安全性及保健功能使其具有广阔的应用价值，且其在运动食品、保健食品和化妆品等领域的开发也越来越得到广泛的重视[21]。酵素的发酵过程是一个复杂的混菌发酵过程，微生物特别是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌通过自身的代谢使发酵原料发生复杂的生化反应，在进行发酵原料中糖、脂、蛋白质转化的同时还可以为新型生理物质甚至功能性成分提供前体物质，不仅如此发酵过程还可以有效改善原料中的不良风味。因此，植物酵素是具有多种营养成分和特定保健功能的发酵制品[22]。传统的酵素生产是自然发酵，但周期长且易受发酵环境的影响从而难以保障产品的质量稳定。本研究采用人工发酵方式生产果蔬酵素，并系统探讨了果蔬酵素发酵过程中理化指标及体外抗氧化活性的动态变化；果蝇是被用来研究动物抗衰老活性及机理的常用动物模型[23]，为进一步证明酵素的抗氧化功能，本研究又以果蝇为实验动物，研究了植物酵素对果蝇寿命的影响，并以抗氧化酶活性(SOD)和丙二醛(MDA)含量为指标评价了酵素的体内抗氧化活性。

3.2 在本实验条件下，酵素发酵过程中pH值不断下降最终降低到3.50，还原糖含量则呈现先降低后升高再降低的趋势，最终降低到78.78±3.24 mg/mL，总酸和总多酚的含量总体保持上升趋势，在发酵终点分别达到9.80±1.06 mg/mL和55.04±1.36 μg/mL。韦仕静[14]等测定了西兰花酵素发酵过程中总酚的动态变化，发现其含量呈现先上升后降低的趋势，且最终达到66.31±0.64 μg/mL，含量变化与本实验结果有差异，考虑是否是果蔬中原有多酚含量差异的影响。酵素的DPPH自由基清除能力和还原力均随发酵的进行而增强，与韦仕静、管章瑞等的研究结果相似[13,14]，说明植物酵素具有体外抗氧化活性。实验中发现，酵素在后熟阶段总酸、总多酚含量仍在持续增加而体外抗氧化活性也在不断升高，所以笔者认为后熟过程对酵素中化学成分的累积具有重要作用。在果蝇基础培养基中按照 2%比例添加植物酵素饲喂果蝇会显著提高雄性果蝇的半数死亡时间、平均寿命、最高平均寿命及雌性果蝇的半数死亡时间和最高平均寿命（p＜0.05）。根据《中国保健食品的进展》中延缓衰老功能的检测方法的规定，如果任一剂量组(或二组、三组)的任一性别(或两性)的最高寿命和(或)平均寿命显著长于对照组，即可判定试验样品对果蝇有延缓衰老的功能[24]。因此，从实验结果判断植物酵素对果蝇具有显著的延长寿命、延缓衰老的作用。本实验的体内抗氧化活性显示，2%添加剂量组雌、雄果蝇体内的SOD活力均显著高于对照组（p＜0.05），分别比对照组提高了5.98%和 7.50%；饲喂植物酵素同样降低了果蝇体内MDA的含量，培养基中添加1%和2%的酵素可显著降低雌果蝇体内的MDA含量，而在雄性果蝇培养基中仅添加0.5%的酵素也可显著降低其体内MDA含量（p＜0.05），说明酵素具有较好的机体抗氧化活性。许多研究提示了抗衰老与抗氧化间的直接关系，而酵素的延寿抗衰功效应该是以其中的抗氧化活性成分为物质基础。

3.3 本研究通过植物酵素发酵过程中理化指标、体外抗氧化活性动态变化的监测可以有效指导植物酵素的人工发酵过程并稳定产品质量；以果蝇为模型的酵素延寿抗衰活性方面的功效验证又为植物酵素以及以植物酵素为原料的保健品、保健食品、功能食品和化妆品等的开发提供了实验证据。作为开发应用前景甚为广阔的食品及食品原料，酵素的延寿抗衰机理值得进行深入研究。

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