孤立性心房颤动的C反应蛋白1441C/T多态性及其血清水平

钱志宏 倪悦 葛丹亘

心房颤动(简称房颤)患者血清C反应蛋白(CRP)浓度明显增高[1-2]，CRP 作为一种非特异性的炎症反应指标, 在房颤发病中有一定的指导价值。CRP通过经典途径激活补体系统，能与血管内膜中的脂蛋白结合后，产生大量终末攻击复合物，可氧化损伤心肌细胞和心房细胞，并且引起心房的结构改变[3]，心肌发生纤维化改变，心电传导功能发生异常，引起房颤的发生。CRP血清浓度越高，房颤发作可能性越大。

血清中CRP 是由外界环境因素与本身遗传因素相互作用后的结果。Miller 等[4]通过基因组学研究表明CRP 基因变异对血清CRP 水平有35%～50% 的作用，而CRP基因1441C/T位于3′非翻译区，能明显影响基础水平CRP分泌，并且在炎症刺激下能升高 CRP浓度水平[5]。那么CRP多态性与房颤发病到底有无相关性呢？目前在国内外缺少这两者之间关系的研究。笔者就CRP1441C/T多态性与孤立性房颤(LAF)的发病风险及与血清CRP浓度之间三者之间的关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1研究对象

本研究所有入选对象为苏南地区的汉族人群，均为本院门诊及住院患者，从2010年6月到2016年6月收集 LAF患者共116例，入组前均未行射频消融术，行超声心动图左房直径小于50 mm[(45.22±3.25)mm]，其中阵发性房颤54例，均为入组前30天内有发作，且有明确的心电图支持；持续性房颤62例。LAF入选标准：年龄小于60岁，未发现有明确病因和任何器质性心脏病。其中男72例，女44例，年龄(52.82±3.85)岁作为病例组。选择同期正常体检112例，排除糖尿病和高血压者，并询问病史未有过阵发性心悸者(男70例，女42例)，年龄(51.10±4.68)岁作为对照组。所有入选对象排除严重肝、肾功能异常及甲状腺功能亢进患者；并排除慢性炎症性疾病(两组中性粒细胞数及血沉无异常)。本研究经医学伦理委员会讨论通过，所有入选对象均签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1CRP基因1441C/T检测 采用相应的内切酶进行酶切，上游引物为5′CCCTTCAGTCCTAATGTCC 3′，下游引物为5′GCTCTTGCCTTATGAGTTTT3′。聚合酶链式反应(PCR)体系为30 μl，包括：2X GoTaq Green Master Mix 15 μl，模板DNA 0.5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.75 μl，Nuclease-FreeWater 13ul ，PCR反应条件：95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，52℃ 30 s， 72℃30 s进行36个循环，72℃延伸10 min，反应结束后，取PCR产物5 μl，限制性内切酶Hpych4III( NEB公司)酶切电泳，具体检测方法参照本实验室既往研究[6]。

1.2.2CRP浓度测定 病例组患者入院时，对照组体检时抽取外周静脉血2 ml，置入EDTA抗凝管，静置2 h后，3 000 r/min，离心10 min，收集上层血清，放于-70℃冰柜保存待测。CRP浓度测定，采用ELISA试剂盒。ELISA试剂盒为人-hsCRP试剂盒；厂家：厦门慧嘉生物，货号：EHJ-10173 h；检测范围：100～2 000 ug/L；变异范围：批内9% 、批间：11%，每个样本测1次，正常人群血清CRP中位数范围：0.58～1.13 mg/L。并严格按照试剂盒说明书进行操作，读取光密度值，并计算其相应浓度值。

1.3统计学分析

2 结果

2.1PCR产物酶切结果

CRP1441C/T位点特异引物 PCR扩增得到 460 bp的片段，PCR产物经限制性内切酶 HpyCH4Ⅲ酶切后，由于HpyCH4Ⅲ可切割C基因型为311、149bp两个片段，故可产生 3种基因型片段：野生型纯合子 (CC)带型为 311、149bp两条条带，杂合子(CT)带型为 460、311和149bp 三条条带，突变纯合子(TT)带型为 460bp一条条带(图1)。

2.2CRP基因型和等位基因频率分布

病例组和对照组 CRP1441C/T基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡；两组间CC、CT基因型频率分布无差异(P=0．375)，仅在病例组发现一个TT基因型；等位基因频率分布：两组含T等位基因频率也无差异(P=0．220)。见表 1。

表1 基因型与LAF关系

2.3两组血清CRP水平

病例组血清CRP水平明显高于对照组，亚组间比较：CC、CT+TT基因型病例组血清浓度明显高于对照组；组内比较时，亚组间CT+TT与CC基因型浓度无差异。见表2。

表2 血清CRP浓度比较 /(mg/L)

3 讨论

房颤是临床常见的快速型心律失常，其发生卒中风险是正常人群4～6倍，死亡风险是正常人群1～2倍，目前已知是一种炎症反应，炎症在房颤的发生和维持中起着重要作用[7]。

人类CRP有206个氨基酸残基组成，编码CRP基因长约2250bp，有2个外显子中间被一个内含子分开，基因位于1号染色体长臂上[3]。Pankow 等[8]研究报道，遗传因素对血清 CRP 水平所起的作用可达 35%～ 40%。CRP1441C/T 位于转录区，为功能性多态性位点，通过转录机制可影响血清中CRP浓度水平。但是，关于CRP1441C/T多态性对血清影响，目前国内外此方面报道结论有部分差异。在国外的研究中，Shakhnovich 等[9]研究认为CRP1441C/T多态性TT纯合子比C等位基因携带的血清CRP水平高；而Pai等[10]对1003例急性心肌梗死患者测试CRP浓度，未发现CRP1441C/T 多态性和血清 CRP 水平间有相关性。国内朱名安等[11]检测250例健康体检者后，发现CRP1441C/T位点有T T 、CT 、CC3种不同基因型，在检测CRP浓度后，发现携带TT基因型血清 CRP浓度明显高于CC基因型；而Yan等[12]检测128例冠心病患者和119例健康人群，却只发现CT、CC两种基因型，并且发现携带CC基因型的血清浓度高与CT基因型，但差异没有统计学意义；而杨海涛等[13]检测221例冠心病患者和161例健康人群，也仅仅发现CT、CC两种基因型，携带CT基因型的血清浓度高与CC基因型，两者也无统计学差异。

从本研究中可以看出，在检测CRP浓度水平后，病例组CRP血清水平明显大于对照组，且在两组亚组中也得到了证实，说明血清 CRP浓度与LAF发病有相关性，CRP浓度越高越易发作LAF；组内比较时，亚组间LAF组与对照组CT+TT基因型血清浓度高于CC基因型血清浓度，但两者血清 CRP水平无统计差异，说明CRP1441C/T 多态性可能与CRP浓度有关；本研究检测CRP1441C/T单核苷酸多态性后，比较两组间基因型频率分布及等位基因频率分布，未发现有统计学差异，但病例组CT基因型及含T等位基因多于对照组，且仅在病例组中发现TT一种基因型，说明CRP1441C/T 多态性可能与LAF有关；含有T等位基因的个体CRP血清浓度较高，这些与国内Yan等[12]，杨海涛等[13]研究相一致，猜测可能由于发生T等位基因突变后，通过转录机制促进血清CRP水平分泌，引起CRP浓度增高，诱发LAF的发生。T突变等位基因可能会提高血清浓度，而C等位基因可能是一个保护因子。

本课题与国外研究存有差异，考虑与种族及地区人群环境差异有关。另外，本研究也存在一些缺陷：入选的研究对象量不大，所选的对照组只是正常健康体检者，可能会有部分房颤患者。CRP1441C/T多态性与LAF的发病风险及与血清CRP浓度之间三者之间的确切关系尚需扩大样本量，联合多中心多地区人群做进一步研究。

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2 Negreva M, Georgiev S, Prodanova K. Significant increase in C-Reactive protein and serum amyloid A in the early hours of paroxysmal atrial fibrillation[J].Cardiol Res, 2016,7(1):1

3 李明民,曾高峰. C反应蛋白及其基因多态性与冠心病的研究进展[J].社区医学杂志, 2008 ,6(21):56

4 Miller DT, Zee RY, Suk Danik J, et al. Association of common CRP gene variants with CRP levels and cardiovascular events[J]. Ann Intern Med, 2005, 69:623

5 刘志忠，吕虹，方芳，等.C反应蛋白基因+1444C/T多态性与缺血性脑卒中的相关分析[J].中国实验诊断学,2009，5 (13)：609

6 何国平,戚猛,高磊,等.CRP 基因 C+1444T 多态性与中国苏皖地区汉族人群 ACS 的易感性无关[J].南京医科大学学报,2011,31(4):522

7 赵利，候月梅.C反应蛋白的心房颤动相关性进展[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2009,23(2):168

8 Pankow JS ，Folsom AR ，Cushman M ，et al ．Familial andgenetic determinants of systemic markers of inflammation ：the NHLBI family heart study [J]．Atherosclerosis ，2001，154(3)：681

9 Shakhnovich PM，Sukhinina TS，Barsova RM，et al ．Polymorphism C +1444T of C-reactive protein gene and C-reactive protein concentration in blood serum of healthypeople and patients with myocardial infarction [J ]．Kardiologiia，2010，50(8)：4

10 Pai JK ，Mukamal KJ ，Rexrode KM ，et al ．C-reactive protein (CRP ) gene polymorphisms ，CRP levels ，and risk ofincident coronary heart disease in two nested case-controlstudies[J]．PLoS One，2008，3(1)：1 395

11 朱名安，周有利，吕军，等．C反应蛋白基因多态性1444C>T与血清CRP水平的相关性分析[J]．郧阳医学院学报，2007，26(1)：13

12 Yan M，Zhao L，Zheng F，et al．The relationship betweengene polymorphism and CRP level in a Chinese Han population[J]．Biochem Genet，2007，45(1/2)：1

13 杨海涛，何国平，戚传平，等.CRP水平及基因多态性和急性心肌梗死发病风险的关系[J].重庆医学，2013,42(27)：3 222