蝎毒多肽干预CML K562细胞Hedgehog通路上游活化因子的分子机制研究

张伟锋，杨文华

蝎毒多肽提取物（PESV）是中药全蝎的有效成分［1］。前期研究表明，PESV可以抑制小鼠白血病细胞的生长、诱导白血病细胞凋亡，并能降低白血病细胞的黏附能力，从而抑制白血病的进展［2］，但其具体的作用机制与靶点尚未清晰。Hedgehog（Hh）信号通路主要存在于人类胚胎发育时期，随着年龄的增长逐渐失去活性［3］。近年来研究表明，肿瘤的发生与Hh通路的再次活化密切相关，Hh通路的活化可能导致肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生［4-5］。其在白血病的发病中亦起重要作用，Irvine等［6］研究表明，Hh通路与慢性粒细胞白血病（CML）的发病相关，Hh通路抑制剂可以通过靶向CML干/祖细胞，提高CML的治疗反应。本研究旨在为进一步探讨PESV是否可以通过调控Hh通路的活化来达到抑制CML的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）主要试剂。RPMI 1640、FBS（美国Gibco公司），Trizol kit、PCR试剂盒及SYBR Green荧光燃料MIX（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国MBI公司），兔抗人Shh抗体、兔抗人Smo抗体及兔抗人Ptch抗体（武汉博士德公司），β-actin单克隆抗体（Santa Cruz，USA），HRP标记的二抗试剂盒（北京博奥森生物公司），PVDF膜（孔径为0.22 μm，美国Millipore公司），医用X射线胶片（美国柯达公司）。引物序列，Shh：上游5′-TGCTAGGGATCGGTGGATAG-3′，下游 5′-ACAAGT⁃CAGCCCAGAGGAGA-3′；Smo：上 游 5′-TGGT⁃CACTCCCCTTTGTCGTCAC-3′，下游5′-GCACGGTATCGG⁃TAGTTCTTGTAGC-3′；Ptch：上 游 5′-TTCCAGTTAAT⁃GACTCCCAAGCAAATG-3′，下游 5′-GCGACACTCTGAT⁃GAACCACCTC-3′；β-actin：上游 5′-CGTGCTGCTGACC⁃GAGG-3′，下游5′-GAAGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3′。（2）主要仪器。培养瓶、96孔培养板（Corning Incorporated）、超净工作台（苏净集团）、5%CO2恒温培养箱（Thermo Forma）、倒置显微镜（Olympus）、电子天平（Sartorius）、微量加样器（Gilson）、酶标仪（BIO-RAD）、低温离心机（Sigma）。

1.2 药物制备 人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞，由中国医学科学院血液学研究所提供。PESV系将蝎毒粗毒应用分子筛层析技术提纯所得，真空干燥后制成干粉，为相对分子量6 000～7 000的多肽混合物，纯度为89.1%；甲磺酸伊马替尼粉剂（GLEEVEC）由中国医学科学院血液学研究所提供，使用前以生理盐水溶解，针头式滤器过滤除菌，稀释到分组所需浓度。

1.3 方法

1.3.1 细胞的培养及分组处理 常规复苏冻存细胞，用完全生长培养基在37℃，5%CO2的条件下常规培养，3～4d传代一次；收集对数生长期细胞以1×105/mL浓度接种于24孔培养板，每孔200 μL细胞悬液，分别加入低、中及高浓度（10、20及40 mg/L）PESV 20 μL（低、中、高剂量组），GLEEVEC（2 g/L）20 μL（GLEEVEC组），生理盐水20 μL（阴性对照组），每组均设3个复孔，共培养48h。

1.3.2 Real-time PCR检测Shh、Smo、Ptch基因mRNA的表达 取上述细胞，各自吹打后，用移液器吸取细胞悬液，置于无菌无RNase的2 mL Eppendorf管中，1 800 r/min离心5 min，用DEPC水配制的l×PBS洗2次，轻柔悬浮细胞，调节细胞浓度调整为5.0×105/mL，应用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，将获得的cDNA模板稀释后用于Real-time PCR，20 μL反应体系包含PCR Mixes 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 7μL，反应条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72 ℃终延伸5 min。设β-actin为内参，采用2-ΔCt法进行定量分析，计算目的基因与β-actin相对表达量，实验重复3次。

1.3.3 Western blot检测Shh、Smo、Ptch蛋白的表达 收集各组K562细胞，1 000 r/min离心5 min，1 mL冷PBS重悬计数；再次离心后用冷PBS洗涤沉淀2次，1 000 r/min离心5 min并转移至1.5 mL EP管；按1×106细胞/100 μL的比例加细胞裂解液，混匀后冰浴放置30 min。4℃，12 000 r/min离心10 min；取上清，应用BCA法进行蛋白浓度测定。样本煮沸后，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中进行电泳，电泳后转膜，0.5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜60 min，分别加入Shh、Smo、Ptch一抗4℃孵育过夜，次日1×TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育60 min，1×TBST洗膜3次，加ECL显影、定影后拍照，实验重复3次。

1.3.4 各组K562细胞BCR/ABL基因mRNA及其融合蛋白P210bcr/abl的表达 应用Real-tmie PCR和Western blot检测PESV及GLEEVEC对K562细胞融合基因及融合蛋白的表达情况，PCR引物：上游5′-TGTTGACTGGCGTBATGAAGTP⁃GCTTGG-3′,下游 5′-TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT-3′；β-actin：上游5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′，下游5′-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3′。实验步骤同 1.3.2、

1.3.3 ，实验重复3次。1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1BCR/ABL融合基因mRNA及P210bcr/abl蛋白的表达 与阴性对照组比较，PESV各剂量对K562细胞BCR/ABL融合基因mRNA及P210bcr/abl蛋白的表达均有不同程度的抑制作用，其中高剂量组表达下降最为明显（P＜0.05），但低剂量组BCR/ABL融合基因mRNA的表达差异无统计学意义；各剂量组BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白表达水平均高于GLEEVEC组（P＜0.05），见表1，图1、2。

2.2Shh、Smo、PtchmRNA的表达 与阴性对照组比较，中、高剂量组Shh、Smo、Ptch基因相对表达水平均降低，低剂量组仅Smo基因相对表达水平降低（P＜0.05）；与GLEEVEC组比较，中、高剂量组Shh、Smo、Ptch基因相对表达水平差异均无统计学意义，见表2、图3。

Tab.1 The mRNA expressions of BCR/ABL gene and P210bcr/ablin five groups表1 各组BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白的表达 （n=3，±s）

Tab.1 The mRNA expressions of BCR/ABL gene and P210bcr/ablin five groups表1 各组BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白的表达 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01，a与阴性对照组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，d与高剂量组比较，P＜0.05

组别阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组GLEEVEC组F BCR/ABL融合基因mRNA 1.335±0.056 1.209±0.046 0.903±0.062ab 0.837±0.053ab 0.523±0.019abcd 125.947＊＊P210bcr/abl蛋白0.976±0.027 0.823±0.054a 0.701±0.081a 0.643±0.061abc 0.415±0.036abcd 49.041＊＊

Fig.1 BCR/ABL mRNA expressions in five groups图1 各组BCR/ABL融合基因mRNA

Fig.2 P210bcr/ablexpressions in five groups图2 各组P210bcr/abl蛋白表达

Tab.2 The relative expressions of Shh,Smo and Ptch gene mRNA in five groups表2 各组Shh、Smo、Ptch基因mRNA相对表达量（n=3，±s）

Tab.2 The relative expressions of Shh,Smo and Ptch gene mRNA in five groups表2 各组Shh、Smo、Ptch基因mRNA相对表达量（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与阴性对照组比较，b与低剂量组比较，P＜0.05

组别阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组GLEEVEC组F Shh 1.813±0.316 1.611±0.252 1.134±0.204ab 1.029±0.197ab 0.951±0.217ab 7.144＊Smo 2.136±0.187 1.890±0.096a 1.293±0.076ab 1.214±0.101ab 1.221±0.083ab 41.732＊＊Ptch 0.933±0.051 0.903±0.036 0.557±0.039ab 0.542±0.053ab 0.511±0.046ab 63.829＊＊

Fig.3 Comparison of Shh,Smo and Ptch mRNA expressions between five groups图3 各组Shh、Smo、Ptch基因mRNA表达比较

2.3 各组Shh、Smo、Ptch蛋白的表达 与阴性对照组比较，中、高剂量组Shh、Smo、Ptch蛋白在K562细胞中的表达水平均降低（P＜0.05），低剂量组表达差异则无统计学意义；与GLEEVEC组比较，中、高剂量组Shh、Smo、Ptch蛋白相对表达水平差异均无统计学意义，但低剂量组均升高（P＜0.05），见表3、图4。

Tab.3 The relative contents of Shh,Smo and Ptch proteins in five groups表3 各组Shh、Smo、Ptch蛋白相对含量（n=3，±s）

Tab.3 The relative contents of Shh,Smo and Ptch proteins in five groups表3 各组Shh、Smo、Ptch蛋白相对含量（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与阴性对照组比较，b与低剂量组比较，P＜0.05

组别Shh/β-actin Smo/β-actin Ptch/β-actin阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组GLEEVEC组F 0.521±0.053 0.477±0.053 0.356±0.070ab 0.361±0.083ab 0.347±0.079ab 4.134＊0.826±0.088 0.770±0.096 0.601±0.039ab 0.593±0.047ab 0.577±0.046ab 8.816＊0.333±0.057 0.278±0.066 0.203±0.049ab 0.194±0.063ab 0.147±0.042ab 5.199＊

Fig.4 Comparison of Shh,Smo and Ptch protein expressions between five groups图4 各组Shh、Smo、Ptch蛋白表达比较

3 讨论

K562细胞是从CML患者中分离的白血病细胞株，具有Ph染色体及BCR/ABL融合基因的特征性表达，而后者已被临床作为CML的重要诊疗依据，因此本实验选择K562细胞作为研究载体。Hedgehog信号通路主要由Hh配体、跨膜受体蛋白Ptc、G蛋白偶联受体样蛋白Smo、核转录因子蛋白Gli组成；当细胞外存在Hh配体时，Hh和Ptc的相互作用能解除Ptc对Smo的抑制作用，使Smo可与相关受体结合，抑制蛋白激酶A活性，从而使Gli以全长进入到细胞核中，启动Hh靶基因的表达［7］。Turner等［8］最新研究表明，Hedgehog通路在CML中高表达，与本研究结果一致。

目前，络氨酸激酶抑制剂（TKIs）在CML的治疗中已经发挥着重要作用。第一代TKI药物GLEEVEC是CML治疗的首选，但临床仍有相当一部分患者对GLEEVEC不耐受，有血细胞减少、肝功能损伤、胃肠道反应等不良反应［9］；虽然这些不良反应可能是可控的，但是严重干扰了患者的规范化治疗，影响到患者的长期生存甚至对TKIs产生耐药［10］，急需寻求与TKIs疗效相当或者联合应用可以减毒增效的药物，因此，中药及其提取物成为研究热点。

PESV的抗白血病效应不仅可以通过下调白血病干细胞膜上P-gp、细胞质内ALDH、PI3K及细胞核中多药耐药基因1（MDR1）、核因子（NF）-κB的表达水平，增强白血病细胞对阿霉素（ADM）的敏感度［11］；还能够抑制白血病KG1a干细胞增殖，对柔红霉素（DNR）损伤的KG1a干细胞有诱导凋亡和分化的作用，其机制可能与上调KG1a干细胞的PTEN、tie-2基因表达有关［12］，同时PESV也可以通过抑制模型小鼠体内BCR/ABL融合基因及P210bcr/abl表达水平进而阻断CML的进展，但是其相关作用机制尚未明确。本研究结果显示，PESV可抑制K562细胞BCR/ABL融合基因及P210bcr/abl蛋白的表达，中、高剂量组与GLEEVEC组相比差异有统计学意义，提示PESV虽然可以抑制该融合基因及蛋白的表达，但抑制程度较GLEEVEC弱。而本课题组前期研究表明PESV对K562细胞增殖的抑制与GLEEVEC相当，考虑原因可能与PESV的作用靶点复杂相关。但关于Hh信号通路的研究结果显示，其上游活化因子Shh、Smo、Ptch基因的mRNA和蛋白在K562细胞中均存在高表达，验证CML的发病确实与该通路密切相关，应用PESV干预之后，Shh、Smo、Ptch的表达水平均有不同程度的下降，其中PESV中高剂量组与BCR/ABL融合基因靶向药物GLEEVE效果相当，提示PESV可以通过降低上游活化因子的表达来抑制Hh通路的活化，达到抗CML的效应，且与GLEEVE效应相当。

CML的Hh通路相关的研究目前尚处于体外实验阶段，但其取得的良好结果可以为体内实验提供研究基础，而PESV和Hh通路在TKIs耐药的CML方面的研究也需进一步探讨。

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