金枪鱼眼透明质酸的提取工艺研究

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(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州310014；2.浙江海博食品有限公司，浙江 舟山 316100)

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，是一种阴离子酸性粘多糖，由β-(1→3)-D-N乙酰氨基葡萄糖与β-(1→4)-D-葡萄糖醛酸双糖单位重复连接而成[1-2].透明质酸具有独特的保湿性和生物亲和性，并具有多种生物功能[3]，在化妆品、医药新型材料等领域有重要的应用.目前透明质酸的生产工艺主要有生物组织提取法和链球菌发酵法[4-5].以鸡冠和人类脐带等陆生动物所提取的透明质酸存在禽流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒等生物污染风险.而金枪鱼眼来源的透明质酸因种属差异，具有更高生物安全性.目前有许多对金枪鱼废弃内脏、鱼骨进行综合利用的研究[6-7]，但是金枪鱼头因无法利用造成大量浪费和污染.因此以金枪鱼眼作为原料提取透明质酸，降低了透明质酸的提取成本，可以为我国低附加值的金枪鱼产业提供更多的选择.传统生物组织提取法常使用乙醇沉淀法[8]、季铵盐络合法[9]和柱层析法[10]纯化透明质酸，在国内外都有广泛应用，但是对季铵盐络合法纯化透明质酸并没有做深入研究优化.本实验首次使用金枪鱼眼为原料，利用季铵盐在不同盐离子浓度下与HA络合、解离的性质分离多糖，使用十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride monohydrate，CPC)纯化透明质酸.本实验对鱼眼透明质酸进行丙酮脱脂、酶解、Savage法和乙醇沉淀法等处理，并且优化了CPC络合条件，所得透明质酸与离子交换柱法[10-11]比较，得到了一条合理的工艺生产路线，为金枪鱼眼透明质酸提取利用提供了应用基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜金枪鱼眼(浙江海博食品有限公司)；CPC、葡萄糖醛酸标准品、四硼酸钠、牛血清蛋白、胰蛋白酶(生工生物工程(上海)有限公司)；DEAE-纤维素52(Whatman)；透明质酸标准品(Sigma)；浓硫酸使用优级纯；95%乙醇、无水乙醇、氯仿、丙酮和正丁醇均使用分析纯.

UV2600A紫外分光光度计(优尼柯(上海)仪器有限公司)；HJ-3恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)；赛默飞Sorvall ST 16R高速离心机(杭州宝诚生物技术有限公司)；冻干机(沈阳北冰洋食品工程有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 金枪鱼眼透明质酸提取工艺流程

新鲜鱼眼采用丙酮脱脂、胰蛋白酶水解法、Savage法、乙醇沉淀法和CPC法等手段提取纯化金枪鱼眼透明质酸，具体操作过程如图1所示.

图1 金枪鱼眼透明质酸提取纯化路线图Fig.1 Extraction and purification of hyaluronic acid

1.2.2 透明质酸质量分数测定

根据透明质酸结构计算可得，每100 mg透明质酸水解可产生48.38 mg.使用葡萄糖醛酸标准品作标准曲线.采用Bitter等[12]咔唑法测定葡萄糖醛酸含量，乘以系数2.07可得样品中HA的质量分数.葡萄糖醛酸标准曲线为A=0.010 24C+0.002 24，R2=0.999 74.

1.2.3 蛋白质量分数测定

使用牛血清白蛋白标准品作标准曲线.采用Bradford[13]法测定样品中蛋白质量分数.蛋白标准曲线为A=0.006 2C-0.004 4，R2=0.999 5.

1.2.4 十六烷基氯化吡啶法纯化透明质酸

使用500 mL低浓度NaCl溶液溶解透明质酸沉淀，抽滤后作为母液，加入一定量的1% CPC溶液搅拌反应.沉淀完全后，所得沉淀使用高浓度NaCl溶液解离，得解离液，再次抽滤后使用三倍体积95%乙醇醇沉，沉淀冷冻干燥.测定纯化后样品HA质量分数和蛋白质量分数，检测母液与解离液除蛋白率，透明质酸回收率.

1.2.5 DEAE-纤维素层析柱纯化透明质酸

装填DEAE-纤维素52层析柱，柱体积约为180 mL.将透明质酸粗品20 mg使用5 mL蒸馏水溶解，过离子交换柱.使用蒸馏水冲洗200 mL，后续再使用1.0 mol/mL NaCl溶液作为洗脱剂，冲洗400 mL，流速0.6 mL/min，每5 mL收集一管，采用上述硫酸咔唑法检测HA质量分数，根据吸光度绘制洗脱曲线.将含HA较高的洗脱液使用乙醇沉淀，沉淀冷冻干燥，得到纯化后的的透明质酸.

1.2.6 透明质酸的红外光谱分析

取透明质酸标准品，纯化后透明质酸样品各1～2 mg，使用溴化钾压片，在400～4 000 cm-1下扫描.

2 结果与讨论

2.1 鱼眼透明质酸的提取

取新鲜鱼眼4 314 g，采用丙酮脱脂，烘干粉碎的鱼眼丙酮粉210 g.取25 g鱼眼丙酮粉使用胰蛋白酶水解法、Savage法和乙醇沉淀法初步提取并分离所含透明质酸.胰蛋白酶水解条件为温度45 ℃，时间2 h，pH=8.5，V(水提液)∶V(胰蛋白液)=250∶1，胰蛋白液质量浓度为1 g/L.所提透明质酸质量分数为83.1%，蛋白质量分数为2.1%，得率为0.013%.此步骤为原料制备，即操作流程图1中乙醇沉淀后产物.将所得透明质酸配成0.1%的HA溶液500 mL作为后续CPC法工艺优化实验的样品液.

2.2 CPC法纯化透明质酸的优化

2.2.1 HA-CPC络合时间对HA回收率的影响

考察HA-CPC络合反应时间对HA回收率的影响，如图2所示.HA溶液加入过量1% CPC溶液反应，每隔30 min取样1 mL，离心后测清液HA吸光度，计算出HA质量分数并计算出HA回收率.

图2 反应时间对HA回收率的影响Fig.2 Effects of extraction time on percent recovery of HA

从图2可知：透明质酸与十六烷基氯化吡啶在低盐环境下形成络合物，在60 min内即可反应完全，HA回收率可达97.2%.当反应时间延长，HA回收率缓慢降低，这可能是HA-CPC在溶液中部分解离造成的.同时，过量的CPC也无法回收溶液中残留的HA，因此HA-CPC络合反应时间控制在60 min为宜.

2.2.2 CPC使用量对HA回收率和蛋白质量分数的影响

使用约0.1% HA溶液500 mL样品液，加入一定量的NaCl，再分别加入不同体积的1% CPC溶液，反应60 min后，解离，醇沉，检测并计算出HA回收率，HA质量分数，蛋白质量分数指标，如图3所示.

图3 1% CPC使用量对HA回收率、HA质量分数和产品蛋白的影响Fig.3 Effects of 1% CPC dosage on percent recovery of HA，HA purity and protein content

从图3可知：HA回收率随着CPC使用量增加而上升，达到95.2%左右，随后便保持稳定.但是蛋白质量分数有了较大提高，成品HA的质量分数出现了比较明显的下降，这可能是由于过量的CPC会与溶液中带负电的蛋白质络合，产生沉淀，并且在高盐环境解离的时候破坏了这种络合条件，再次游离出来造成的.同时，HA-CPC络合物在易粘附在杯壁、杯底，部分蛋白也会粘附在上面，故造成蛋白的增加.另外，推测CPC与HA并不是一对一络合的，过量的CPC会造成聚团沉淀现象，同时在解离过程中游离出更多的CPC，对HA产品质量分数造成较大影响，因此CPC使用量在HA回收率不再增加时即可，本实验中500 mL约0.1% HA溶液使用40 mL 1.0% CPC为宜，即V(0.1% HA溶液)∶V(1.0% CPC溶液)=25∶2.

2.2.3 酶解法、醇沉法和CPC法除蛋白效率的比较

鱼眼透明质酸水提液分别使用酶解法、醇沉法和CPC络合法纯化透明质酸，通过测初始蛋白质量分数和剩余蛋白质量分数，计算蛋白质去除率，如图4所示.

图4 常用方法蛋白质去除率的比较Fig.4 Comparison of common methods for protein removal rate

从图4可以看出：透明质酸水提液直接使用酶解法其蛋白质去除率可达88.1%，醇沉法蛋白质去除率为60.7%，CPC络合法蛋白质去除率为62.6%.CPC络合法并不比传统酶解法、醇沉法对蛋白有更好的分离效果，这主要是不同蛋白的等电点不同，部分蛋白在水中带负电与CPC络合造成干扰.并且，生物组织所提取的透明质酸往往是和蛋白质结合的形式存在，因此使用蛋白酶处理鱼眼透明质酸水提液能很好地分解透明质酸与蛋白质的结合位点，为后续除蛋白的流程提供便利.综上所述，在使用CPC法纯化HA前应尽量除去HA溶液中的蛋白，本实验最终确定的工艺流程先使用胰蛋白酶解法、Savage法、乙醇沉淀法和CPC法，其蛋白质量分数最终小于0.1%达到化妆品级别.

2.2.4 盐离子浓度对HA和CPC络合的影响

分别配置500 mL 0.1% HA的样品液，加入一定量的NaCl使其盐浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L，加入40 mL 1% CPC溶液，反应60 min后取样1 mL并离心，检测上清液HA体积分数，计算出HA回收率，如图5所示.

图5 NaCl浓度对HA、CPC络合的影响Fig.5 Effects of NaCl concentration on percent recovery of HA

由图5可知：透明质酸在NaCl浓度为0 mol/L时几乎不和CPC络合，在0.1 mol/L至0.2 mol/L浓度下能和CPC较好的结合，HA回收率在95.2%左右，当NaCl浓度逐渐增加，HA回收率明显下降.因此，HA溶液应添加适量NaCl，但其浓度应控制在0.2 mol/L以内.

2.2.5 盐离子浓度对HA-CPC络合物解离的影响

实验室使用浓度为0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mol/L的NaCl溶液解离HA-CPC络合物，解离液抽滤后醇沉，沉淀真空干燥.检测样品HA质量分数，计算HA回收率，如图6所示.

图6 NaCl浓度对HA、CPC络合的影响Fig.6 Effects of NaCl concentration on percent recovery of HA purity

由图6可以看出：过低浓度的NaCl溶液并不能很好地解离HA-CPC络合物，当NaCl溶液浓度达到0.4 mol/L时，HA回收率达到91.3%并随着NaCl浓度继续增加保持稳定.但是，终产品HA的质量分数出现了较为明显的下降.根据文献[14]报道，CPC能在低盐的环境和许多酸性粘多糖(硫酸软骨素、皮肤软骨素和肝素等)形成络合物，并在不同的高盐浓度下分步解离.本实验中，金枪鱼眼所提取的HA可能被所包含的硫酸软骨素等杂多糖影响质量分数.不同粘多糖的解离浓度是根据其电荷密度与酸根数量决定的(表1)，故高浓度的NaCl溶液会解离杂多糖与CPC形成的络合物，进而影响产品纯度.因此，在解离HA-CPC络合物时应严格控制NaCl浓度，以达到不同粘多糖络合物的解离条件，进而能大大减少HA产品里面其他粘多糖的干扰，由图6可得NaCl浓度为0.4 mol/L为最佳解离浓度.

表1 粘多糖的电荷密度和酸根值Table 1 Mucopolysaccharide charge density and acid radical

使用经过优化的CPC法工艺流程进行验证试验，CPC络合反应时间为60 min，V(0.1% HA溶液)∶V(1% CPC溶液)=25∶2，络合反应NaCl浓度为0.2 mol/L，解离反应NaCl浓度为0.4 mol/L时，能达到最好的分离效果，HA回收率91.3%，HA质量分数90.1%，蛋白质量分数为0.1%.王婧茜[15]也做了CPC法纯化透明质酸的工艺优化，主要包括反应温度、CPC使用量和初始溶液浓度等；而本实验着重对CPC反应时盐离子的浓度进行了实验，并以透明质酸质量分数、蛋白质量分数为指标进行优化，最终结果也表明按照本实验优化方案所得的透明质酸质量分数为90.1%，高于之前的研究(78.3%).

2.2.6 离子交换柱法纯化透明质酸

使用蒸馏水冲洗200 mL，后续再使用1.0 mol/mL NaCl溶液作为洗脱剂，冲洗400 mL，流速0.6 mL/min，每5 mL收集一管，采用上述硫酸咔唑法检测HA质量分数，根据吸光度绘制洗脱曲线见图7.

由图7可知：当洗脱液为蒸馏水时，即洗脱体积为0～200 mL时，没有明显的峰出现，HA没有被洗脱下来.当洗脱液为1.0 mol/mL NaCl时，即洗脱体积为330～400 mL时出现了明显的狭窄的洗脱峰.此方法纯化的透明质酸回收率为74.3%，HA质量分数为92.2%，蛋白质量分数为0.1%.

2.3 IR分析

透明质酸标准品和金枪鱼眼提取纯化透明质酸红外图谱如图8所示.

由图8(a)可知：在3 417.8 cm-1处有强烈的—OH伸缩振动的吸收峰，其峰宽而钝，表明透明质酸分子内羟基是通过分子内或者分子间氢键结合的.1 621.3 cm-1和1 411.6 cm-1为COO—的反对称和对称伸缩振动峰；1 148.3 cm-1和1 047.8 cm-1为多糖的特征吸收峰.与图8(b)作比较，二者在特征区与指纹区主要吸收峰基本一致[16]，表明图8(b)中检测的样品与Sigma所购透明质酸标准品一致，并且图8(b)没有蛋白和碱基的吸收峰，说明样品的质量分数较高.

图8 透明质酸红外扫描图谱Fig.8 Infrared absorption spectrum of hyaluronic acid

3 结 论

本实验确定了一条废弃金枪鱼眼提取透明质酸的工艺流程，通过酶解、醇沉和Savage等方法去除透明质酸中的蛋白，CPC络合法纯化透明质酸.本实验以透明质酸回收率、HA质量分数和蛋白质量分数为指标，优化CPC络合法纯化透明质酸的条件.所得终产品HA质量分数为90.1%，蛋白质量分数为0.1%，HA回收率为91.3%，所得的HA符合化妆品级别.通过离子交换法所得的HA样品，HA质量分数为92.2%，蛋白质量分数0.1%，HA回收率74.3%.该方法虽然能够进一步提高HA品质，但是会造成HA的损失，并且由于进样量、生产成本等因素的限制，更适合用于实验室纯化研究.实验采用的工艺流程简单、有效，为金枪鱼眼透明质酸提取利用提供了应用基础.实验中所得产品符合国家化妆品标准，但若要应用于医药行业，需要进一步提高透明质酸质量分数.HA质量分数为90.1%，所含杂质可能为其他酸性粘多糖、中性粘多糖和无机盐等，在之后的研究中，应分析所提透明质酸中的杂质成分，根据不同杂质对工艺流程进行优化.若所含杂质为酸性粘多糖，则CPC法纯化金枪鱼眼透明质酸的工艺条件可以进一步优化，以得到质量分数更高的透明质酸.本实验从金枪鱼眼中提取透明质酸得率为0.013%，虽然相较于鸡冠、脐带较低，但因我国金枪鱼产业巨大，废弃鱼眼量多，故此工艺路线具有工业化潜力.

参考文献：

[1] 张堃，简军，张政朴.透明质酸的结构，性能，改性和应用研究进展[J].高分子通报，2015(9):217-226.

[2] LAURENT T C， LAURENT U B G， FRASER J R E. The structure and function of hyaluronan: an overview[J]. Immunology & cell biology，1996，74(2):1-7.

[3] 冯海，黄鑫，苏李，等.交联透明质酸体外降解和细胞毒性研究[J].浙江工业大学学报，2011，39(6)：630-634.

[4] RANGASWAMY V， JAIN D. An efficient process for production and purification of hyaluronic acid fromStreptococcusequisubsp.zooepidemicus[J]. Biotechnology letters，2008，30(3):493-496.

[5] VULGANOVA K， URGEOVA E. Extraction of hyaluronic acid from eggshell membranes[J]. Current opinion in biotechnology，2013(24):S106.

[6] 秦乾安，周小敏，励建荣.鱿鱼眼提取透明质酸去蛋白质酶解工艺研究[J].食品工业科技，2009(1)：214-216.

[7] 廖启元，钱俊育，姜洪峰，等.自溶法回收鱼类加工废弃物中鱼油的研究[J].浙江工业大学学报，2006，34(3)：294-297.

[8] MURADO M A， MONTEMAYOR M I， CABO M L， et al. Optimization of extraction and purification process of hyaluronic

acid from fish eyeball[J]. Food and bioproducts processing，2012，90(3):491-498.

[9] 黄小红，吴泽杰，钟志威，等.发酵液中透明质酸的分离纯化[J].食品研究与开发，2011，32(8)：111-113.

[10] 王鑫，徐丽萍，王派丽.阴离子交换树脂法纯化透明质酸工艺的研究[J].食品研究与开发，2015，36(2)：45-48.

[11] 谢捷，罗小芳，朱兴一，等.离子交换法分离纯化猪硫酸软骨素的研究[J].浙江工业大学学报，2012，40(2)：124-128.

[12] BITTER T， MUIR H M. A modified uronic acid carbazole reaction[J]. Analytical biochemistry，1962，4(4):330-334.

[13] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein dye binding[J]. Analytical biochemistry，1976，6(s1/2):3177-3188.

[14] 凌沛学.透明质酸[M].北京：中国轻工业出版社，2000.

[15] 王婧茜.酶膜反应器制备透明质酸的研究[D].杭州：浙江工业大学，2015.

[16] 倪杭生，李润，贺艳丽，等.透明质酸的离子交换层析纯化[J].中国医药工业杂志，2001，32(11)：485-488.