2016—2017年广西4种野生鸟类新城疫病原学检测与遗传进化分析

谢丽基，谢芝勋，罗思思，邓显文，谢志勤，王 盛，黄娇玲，曾婷婷，张艳芳，范 晴，张民秀

（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的，以感染禽类为主的一种急性、烈性传染病[1]。尽管NDV只有1个血清型，但不同毒株间的生物学特性存在明显差异。根据NDV F基因高变区序列差异，可将毒株分为两类：Ⅰ类（ClassⅠ）和Ⅱ类（ClassⅡ）[2-3]。Ⅱ类NDV流行时间较长，至少包括18个基因型。导致世界各国ND大流行的强毒株和常用弱毒疫苗株均属于此分支[4-5]。

与Ⅱ类相比，Ⅰ类NDV出现较晚。我国2008年后陆续检测和分离到了Ⅰ类 NDV[6-7]。虽然研究表明所有Ⅰ类NDV均为无毒或弱毒株，但已有学者证实Ⅰ类NDV可通过在鸡或鸡胚中连续传代增强毒力[8-9]。野鸟是NDV的自然储存宿主，可作为病毒的传播媒介，随自然迁徙将病毒传染给家禽，导致家禽ND的暴发[10]。新疆、吉林、湖南和陕西等地对野生鸟类进行了ND监测，探索了野生鸟类与家禽NDV感染的区别和联系，通过分析NDV遗传进化情况，预测了家禽NDV感染的流行趋势，为ND防治提供了理论依据[10-15]。

广西是鸟类的主要迁徙地，同时拥有庞大的野生鸟类资源[16]，因此有必要对广西野鸟携带的Ⅰ类和Ⅱ类NDV都进行监测。本研究于2016—2017年在广西采集4种野生鸟类的口咽/泄殖腔棉拭子样本进行病毒分离鉴定，并对分离毒株进行遗传进化分析，从而为科学防控ND提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

病毒基因组RNA/DNA快速纯化试剂盒和DNA片断胶回收试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司；Prime Script II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM试剂盒和PMD18-T试剂盒：购自大连宝生物公司。

1.2 样品和SPF鸡胚

样品：采自2016—2017年广西野生动物救护中心收容和救护的4种野鸟；SPF鸡胚：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，由本实验室无菌孵化至9～11日龄。

1.3 病毒分离鉴定

将采集的咽喉/泄殖腔棉拭子，放入青-链霉素PBS溶液中，低温（4 ℃）作用4 h，然后充分捻转、挤压，3 000 r/min离心10 min；取上清接种9～11日龄SPF鸡胚，收获24～96 h内死亡或活胚的鸡胚尿囊液，通过血凝试验（HA）、血凝抑制（HI）试验进行病毒鉴定。

1.4 核酸提取

参照RNA/DNA快速纯化试剂盒说明书，对HA和HI鉴定为NDV阳性的尿囊液提取RNA。

1.5 RT-PCR扩增

参照PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit说明书，对提取的RNA进行反转录合成cDNA。使用国标 GBT 16550—2008和文献[2，17]中的引物（表1），对NDV F基因进行PCR扩增。国标GB/T 16550—2008中的引物未说明扩增Ⅰ类，还是Ⅱ类NDV，文献[2]中的引物说明特异扩增Ⅰ类NDV，文献[17]中的引物说明可扩增Ⅰ类和Ⅱ类NDV。将50 µL PCR产物电泳后，切胶经DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。将纯化PCR产物克隆至pMD-18T载体。阳性克隆送深圳华大基因科技服务有限公司进行测序。

表1 试验所使用引物序列

1.6 分离株F基因序列和遗传进化分析

根据测序结果，推导出NDV分离株F基因的氨基酸序列，确定112～117位氨基酸裂解位点基序。从GenBank数据库下载NDV参考序列（表2），利用 MEGA 6软件，对F基因序列进行系统进化分析，采用邻位相连法（Neighbor-joining）构建系统遗传进化树。

2 结果

2.1 病原学检测

2016—2017年在广西4种野鸟中开展了ND病原学检测，共采集野鸟口咽/泄殖腔棉拭子650份，其中斑鸠120份、鹧鸪261份、鸽子215份、山鸡54份。经病毒分离、RT-PCR和序列测定，共分离到10株NDV，病毒分离率为1.54%。10株病毒中，5株来源于斑鸠，3株来源于鸽子，2株来源于鹧鸪（表3）。

表2 NDVF 基因序列分析参考毒株及其F 蛋白裂解位点详细信息

表3 广西地区4种野鸟新城疫病原学检测

2.2 分离株F基因PCR扩增

使用国标GBT 16550—2008中的引物 P1和P2，运用RT-PCR对10 株NDV分离株进行F 基因扩增，仅分离到2株鹧鸪源NDV（“159 鹧鸪19”“158鹧鸪18”）中扩增出535 bp的条带。用文献[2]中的引物进行PCR扩增，结果均为阴性。对另外8株NDV分离株，使用文献[17]中的引物FTY1和FTY2，扩增出 968 bp的条带。10个NDV分离株F基因的PCR扩增电泳结果见图1。

图1 NDV 广西分离株F基因扩增结果

2.3 分离株F基因序列和遗传进化分析

10株NDV分离株的氨基酸裂解位点基序均为112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV强毒株的典型特征。对2016—2017年主动监测中分离到的NDV进行F基因序列测定，构建了系统遗传进化树（图2）。所分离的10株NDV毒株中，8株为Ⅱ类NDV基因VI型（斑鸠源5株、鸽子源3株），2株为Ⅱ类NDV基因XII 型（均从鹧鸪中分离到）。构建系统进化树所用序列为NDV F基因编码区1～374位核苷酸（图2）。

图2 根据F基因1～374 bp核苷酸序列绘制的遗传进化树

3 讨论

据报道，我国新疆、吉林、湖南和陕西等地从野鸟中分离的NDV主要为Ⅱ类NDV的基因I、II和VI型[10-15]。与这些报道类似，本研究也发现了Ⅱ类NDV基因VI型。近年来，我国在家禽中检测到了Ⅱ类NDV基因XII型[6，18]，但未在野鸟中发现。本研究在广西鹧鸪中分离到了基因XII型，因此应关注这种新型NDV在国内野鸟和家禽中的分布和流行情况，加大主动监测力度。由于当前使用的NDV疫苗主要为基因VII、II和I型，鉴于基因XII型的发现，有必要开展当前疫苗对XII型的免疫效果评估。同时，由于本研究样品均采自广西野生动物救护中心收容和救护的野鸟，来源相对单一，为更好地阐明4种鸟类NDV的病原生态学分布，后续应拓宽鸟类样品的采集范围。

本研究中分离到NDV的野鸟状态良好，无发病迹象，因而推测野鸟对基因VI和XII具有较好的适应力与抵抗性，存在向周边环境排毒的危险。广西丰富的鸟类资源为NDV传播创造了便利条件。

NDV 分离株F 蛋白裂解能力是判断毒力的标准之一[19]。强毒株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成是112R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒株相对应的氨基酸组成是112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117[20-21]。本研究分离的10株NDV氨基酸裂解位点基序均为112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV强毒株的典型特征。后续将会进行分离毒株的MDT和ICPI致病指数测定以及全基因序列测定分析。

由于前期在对NDV F基因的PCR扩增中，发现国标中的引物P1和P2仅能扩增Ⅱ类NDV的F基因；文献[2]中注明的引物CI-F和CI-R并不能扩增所有Ⅰ类NDV；文献[17]中注明的引物FTY1和FTY2并不能扩增所有Ⅰ类和Ⅱ类的NDV毒株。这可能是由于NDV F基因变异较大，特别是Ⅰ类和Ⅱ类NDV的F基因。因此，为避免漏检，本研究使用了国标、文献[2]和文献[17]中的3套引物同时进行扩增。此外，由于Ⅰ类NDV可通过在鸡或鸡胚中连续传代增强毒力[8-9]，因此为更好地预测家禽NDV感染的流行趋势，建议在国标中增加Ⅰ类NDV的检测引物。

4 结论

本研究于2016—2017年在广西采集了4种野鸟的650份口咽/泄殖腔棉拭子进行了NDV感染状况调查和分子特征分析，共分离到10株病毒；10株分离毒株均为高致病性，其中8株为Ⅱ类NDV基因VI型，2株为基因XII 型。该结果表明我国野鸟中流行的NDV以基因VI型为主，但也出现了新基因型（基因XII型）。因此，应加大对野鸟NDV监测的力度，防止其将病毒传染给家禽，同时开展当前疫苗对对NDV XII型的免疫效果评估。

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