过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对羊舍环境真菌的消毒效果评价

郭 耀，张艳冰，高晓莎，段晋伟，郑明学，霍乃蕊，刘兴国，古少鹏

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）

环境消毒对控制动物疫病的发生和传播具有重要作用。常用的消毒剂有卤素类、醛类、酚类、醇类、氧化剂类、表面活性剂类和酸碱类等。各类消毒剂作用机制不同，也都存在各自的缺陷，因而制约了其在生产中的应用[1-3]。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂（专利号：ZL 2009 1 0263970.x）是山西农业大学研制的高效广谱消毒剂，能杀灭多种细菌芽孢及病毒，具有迅速、高效、长效和抗干扰能力强的特点[4-5]。目前尚未对该消毒剂对真菌的杀灭作用进行系统研究。动物养殖环境中的大量真菌及孢子，通过气溶胶经呼吸道或伤口进入人和动物体内，引起各种疾病，因而环境消毒可有效遏制真菌性疾病的传播和发生[6-7]。为探究该复方消毒剂对环境真菌的消毒效果，本研究依据《消毒与灭菌效果的评价标准》和《消毒技术规范（2002年版）》，以羊舍环境气载真菌优势菌黑曲霉和青霉及白色念珠菌为指示菌，测定了复方消毒剂、新洁尔灭、癸甲溴铵、聚维酮碘和过氧乙酸5种消毒剂对真菌的杀灭效果，并进行了羊舍现场消毒试验，以期为该消毒剂的推广应用提供依据。

1 材料

1.1 菌株

黑曲霉、青霉，羊舍环境气载优势真菌：本实验室分离鉴定；白色念珠菌标准株（ATCC10231）：晋中市第二人民医院检验科惠赠。

1.2 试剂与仪器

新洁尔灭：山东名德医疗科技公司生产（27～33 g/L）；癸甲溴铵溶液：上海派斯德生化公司生产（10 g，100 mL）；聚维酮碘溶液：山东正邦生物科技公司生产（5%）；过氧乙酸：天津永大化学试剂公司（15%～18%）；过氧乙酸戊二醛复方消毒剂（过氧乙酸含量4%）：本实验室制备；Andersen-6级撞击式空气微生物采样器（TE-10-800）：美国TEI公司；中和剂以及真菌培养基等。

2 方法

2.1 杀灭效果比较

2.1.1 菌悬液的制备 参照《消毒技术规范（2002年版）》，将黑曲霉、青霉和白色念珠菌标准株接种沙氏斜面培养基，27 ℃恒温培养3～5 d，洗下菌苔，振荡分散，稀释成含菌量为1×108～5×108cfu/mL 的菌悬液。

2.1.2 消毒剂的配制 根据产品说明推荐的使用浓度范围（依据课题组前期试验结果，过氧乙酸戊二醛复方消毒剂以1∶256稀释作为推荐使用浓度），用灭菌硬水将5种消毒剂稀释，取推荐使用浓度的最低、中间和最高浓度值（表1）。

表1 5种消毒剂的稀释浓度与有效成分含量

2.1.3 中和剂鉴定试验 以白色念珠菌标准株为试验菌，参照《消毒技术规范（2002年版）》，按悬液定量杀菌试验程序进行中和剂鉴定试验及结果评判。

2.1.4 悬液定性、定量杀灭试验 参照《消毒与灭菌效果的评价标准》和《消毒技术规范（2002年版）》，用灭菌生理盐水制备白色念珠菌、黑曲霉和青霉菌悬液。将菌悬液与配制好的消毒剂分别作用10 min、30 min、2 h、6 h和24 h后，加入到对应的中和剂中，振荡混匀。吸取与中和剂混匀后的液体0.1 mL，用生理盐水做梯度稀释，涂布到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，27 ℃或37 ℃（白色念珠菌）恒温培养3 d后进行菌落计数，同时设菌悬液对照组，重复5次试验。

结果判定如下：杀灭对数值（KL）= lgX-lgX0；X为对照组平均活菌浓度（cfu/mL）；X0为试验组平均活菌浓度（cfu/mL）。当杀灭对数值KL＞3时，消毒合格；当KL＞5时，消毒剂杀菌效果良好。

2.2 羊舍环境消毒试验

2.2.1 消毒场地 选择半封闭羊舍3栋。羊舍及饲养情况见表2。

表2 羊舍参数及饲养情况

2.2.2 消毒方法 过氧乙酸戊二醛复方消毒剂稀释浓度1∶256，按照20 mL/m3剂量对羊舍进行现场喷雾消毒。消毒前先对羊舍环境做湿润处理，使其湿度达到60%～80%，消毒喷雾机加装雾化喷头。

2.2.3 羊舍气载真菌的消毒效果监测 消毒前以及消毒后30 min、6 h和24 h，分别用Andersen-6级撞击式空气微生物采样器采集气载真菌。采样介质为琥红氯霉素培养基；采样高度50～80 cm、流量28.3 L/min，驱动时间3 min。27 ℃恒温培养48～72 h后计数。

2.2.4 对羊舍表面载体消毒效果监测

采样情况同2.2.1。用无菌棉拭子对羊舍内的墙壁、地面及笼具上分别取点擦拭，消毒前后采样点相邻但不重复，涂擦面积为5 cm×5 cm；将棉拭子放入10 mL灭菌洗脱液中［0.5%（吐温-80）+1%卵磷脂+1%甘氨酸+0.5%硫代硫酸钠］进行洗脱处理，然后接种琥红氯霉素培养基培养计数。

2.2.5 平均杀菌率计算 平均杀菌率=（消毒前平均真菌总数-消毒后平均真菌总数）/消毒前平均真菌总数×100%。

3 结果

3.1 中和剂鉴定试验

结果显示中和剂可有效中和对应消毒液对试验菌株的残留作用（表3）。

表3 中和剂的配置

3.2 悬液定性、定量杀灭试验

3.2.1 白色念珠菌 按癸甲溴铵与过氧乙酸最低推荐使用浓度作用10 min，即可达到消毒合格标准；新洁尔灭和聚维酮碘则需要用最高推荐使用浓度，方可杀灭白色念珠菌；而复方消毒剂1∶512稀释或1∶256作用10 min，可达到消毒合格（表4）。

表4 消毒剂定量杀灭白色念珠菌效果

3.2.2 黑曲霉孢子 聚维酮碘、癸甲溴铵与过氧乙酸对黑曲霉孢子的杀灭效能相近，新洁尔灭对黑曲霉孢子的杀灭效果不佳，而复方消毒剂1∶512稀释，作用10 min，即可完全杀灭黑曲霉孢子（表5）。

3.2.3 青霉孢子 聚维酮碘与过氧乙酸按最低推荐使用浓度作用10 min，即可达到对青霉孢子消毒合格；癸甲溴铵需要按推荐中剂量浓度作用30 min或最高推荐浓度作用10 min，才可达到消毒合格；而复方消毒剂1∶512稀释作用30 min或1∶256作用10 min，即可达到消毒合格（表6）。

表5 消毒剂定量杀灭黑曲霉孢子效果

表6 消毒剂定量杀灭青霉孢子效果

3.3 羊舍环境消毒试验

3.3.1 气载真菌消毒效果 参考实验室消毒结果，复方消毒剂在1∶256倍稀释浓度下对指示真菌和试验菌均有良好的杀灭作用，用过氧乙酸戊二醛复方消毒剂以1∶256稀释，20 mL/m3剂量，对羊舍进行喷雾消毒，30 min后舍内气载真菌浓度开始下降，6 h后气载真菌杀灭率分别达到47.8%、61.1%和68.1%，并可持续24 h以上（图1、表7）。

3.3.2 表面载体消毒效果 表面载体消毒后30 min即达到最佳消毒效果，地面、墙壁和笼具的杀灭率分别为89.3%、72.3%和88.7%，并可维持24 h以上（图2）。

4 分析与讨论

图1 半封闭式羊舍消毒前后气载真菌浓度变化

表7 半封闭式羊舍环境指标

图2 半封闭式羊舍消毒前后表面载体真菌浓度变化

新洁尔灭为低效消毒剂。本试验中新洁尔灭对真菌的杀灭效果均不理想，与文献报道一致[10]。聚维酮碘虽表现出良好的杀菌效果，但其推荐的使用浓度接近原液，使用高浓度的聚维酮碘用可能会对皮肤造成损伤[8]，且成本过高。癸甲溴铵的推荐低剂量即可完全杀灭白色念珠菌，对黑曲霉和青霉则需要中、高剂量才可有效杀灭。

本试验中，过氧乙酸与复方消毒剂的低剂量均可有效杀灭真菌，但复方消毒剂中的过氧乙酸仅占4%左右，达到相同消毒效果所需有效成分浓度更低。由于过氧乙酸稳定性较差，对人体具有刺激性和毒性，对物品具有腐蚀性，因而限制了其使用[9-10]。本实验室研制的复方消毒剂，一方面降低了过氧乙酸的使用浓度，从而减小毒性，另一方面通过各成分之间的协同作用，增加了其稳定性和抗干扰性。

各单组分消毒剂对不同菌株的敏感性不尽相同，尤其是黑曲霉对季铵盐类和卤素类消毒剂的耐受性较强，但对氧化型及复方消毒剂较为敏感；聚维酮碘对青霉孢子杀灭效果较好，但对黑曲霉和念珠菌则不够稳定；而复方消毒剂对3种真菌的杀灭效果均比较稳定，1∶256稀释，作用10 min即可完全杀灭，可见消毒剂之间的配伍有益于其抗菌谱和抗干扰能力的增加。

常见的复方消毒剂由消毒剂、增效剂、稳定剂、表面活性剂和缓蚀剂等成分组成。研究发现，过氧乙酸与二氯二甲基海因配伍，可对枯草杆菌芽孢具有快速高效的杀灭作用，戊二醛与季铵盐类消毒剂配伍后，抗干扰能力增强，过氧化氢和许多理化因子都有协同增效的作用[11-14]。

复方消毒剂在现场消毒试验中，对气载真菌的杀灭率为47.1%～68%，且可持续24 h以上，与文献报道相同[15]。但与密闭空间的消毒效果差距较大。这与生产实践中消毒场所无法密闭有关，且羊舍屋顶装有无动力风机，舍内外随时进行气体交换。这提示生产应用中应根据实际情况适当加大使用浓度和剂量[16]，或者密封圈舍。羊舍消毒10 min后，舍内气载真菌浓度不降反升，可能是喷洒过程中将地面墙壁等表面附着沉积的真菌粒子悬浮到于空气中导致的。本试验为带羊消毒，过程中羊群未出现明显的咳嗽、流泪、流涕等表观现象，但相关毒理试验尚需要作出系统评价。本研究只获得了初步评价结果，应进一步对其杀菌谱、使用安全性等进行全方位评估。

5 结论

过氧乙酸戊二醛复方消毒剂在实验室消毒和现场消毒试验中1∶256稀释作用10 min即可高效杀灭真菌孢子，比市售常见消毒剂所需有效成分浓度更低，用时更短。

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