他莫昔芬通过阻断雌激素效应而抑制MCF-7细胞对单核细胞的招募活化

郭永红，丁景弦

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据其激素受体状态可分为激素依赖型乳腺癌和激素非依赖型乳腺癌。两种类型乳腺癌患者生存复发模式迥异，前者总体复发率较后者低，复发时限呈现双峰分布，即在术后3年及术后7年各有一复发高峰，而激素非依赖型乳腺癌复发高峰主要是在术后2年[1]。近年来，越来越多的研究聚焦于肿瘤细胞赖以生存的微环境上。肿瘤微环境即非肿瘤细胞成分，包括细胞外基质和各种基质细胞，它们为癌细胞发生发展提供滋养。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是乳腺癌微环境中的主要组成部分，在肿瘤发展中扮演了十分重要的角色，有望成为乳腺癌治疗的新靶点[2-3]。TAMs由血液循环中的单核细胞游出进入组织后在单核-巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、白介素6（IL-6）及白介素10（IL-10）等的作用下分化而成，通常具有替代活化的M2表型，参与组织修复、基质重塑和血管生成从而促进肿瘤的发展，越来越多的研究表明TAMs的丰度与乳腺癌患者的不良预后呈明显正相关[4-5]。乳腺癌细胞通过分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及M-CSF招募单核细胞并诱导其分化为M2型TAMs，进而导致了血管内皮生长因子的合成，从而促进肿瘤生长。Levano等发现与激素依赖型型乳腺癌相比，激素非依赖型乳腺癌中往往高表达MCP-1及M-CSF，而MCP-1及M-CSF水平与乳腺癌的高侵袭和高转移具有明显的相关性[6-7]。我们发现激素依赖型乳腺癌细胞株MCF-7在体外常规培养时具有高增殖能力，然而不添加雌激素却不能有效形成移植瘤。为此，本研究尝试探讨雌激素对激素依赖型乳腺癌单核细胞活化相关细胞因子表达的影响，并通过他莫昔芬竞争性阻断雌激素下游效应，为内分泌治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 激素依赖型人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国ATCC细胞库，单核细胞株U937由复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系马端教授馈赠。利用GFP-PURO双标即用型慢病毒颗粒和RFP-NEO双标即用型慢病毒颗粒（均购自美国Gent arget公司）分别构建红色荧光蛋白MCF-7和绿色荧光蛋白U937稳定表达株用于本研究。细胞培养于含有10%FBS的RPMI1640（美国GIBCO公司）培养基中，隔天换液，待细胞长到90%时按照1∶3的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。将5×103个人乳腺癌细胞株MCF-7接种于96孔板中，待细胞贴壁后吸出培养上清，每组3个复孔，分别加入100μl无血清培养基、10 nM雌二醇、10 nM雌二醇+1μM他莫昔芬及1μM他莫昔芬无血清培养基继续培养48 h后收集上清，200 g离心5 min除去细胞碎片。上清放置于-80℃冰箱保存待检测。

1.2 细胞因子芯片检测 细胞因子检测试剂盒由Bio-Pl ex公司专门制备。细胞因子芯片利用磁珠吸附原理检测不同培养上清中单核细胞分化相关细胞因子MCP-1及M-CSF浓度，实验操作严格按照说明书操作流程。

1.3 不同处理组MCF-7细胞与U937细胞共培养 将5×105个MCF-7细胞接种于Tr answel l板（6孔，孔径0.4μm）上室中，下室种5×105个U937细胞，共培养48 h后观察不同处理组乳腺癌细胞对U937细胞定向分化M2型TAMs的能力。

1.4 RT-qPCR验证M2型TAMs特异性标记CD163 收集经与不同处理组MCF-7细胞共培养48 h的U937细胞，利用Trizol按实验流程提取总RNA,反转录得到cDNA。内参基因GAPDH扩增片段长度200 bp，上游引物：5’-acccagaagactgtggatgg-3’，下游引物：5’-t ct agacggcaggt caggt c-3’；M2型TAMs特异性标记基因CD163扩增片段长度146bp，上游引物：5’-cgagt taacgccagt aagg-3’，下游引物：5’-gaacat gtcacgccagc-3’。PCR反应条件参考既往发表文献。

1.5 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件作统计分析。计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理组MCF-7细胞培养上清中MCP-1及M-CSF的表达差异 Bio-Rad公司定做的细胞因子芯片利用磁珠吸附原理检测不同处理组乳腺癌细胞株MCF-7培养上清中单核细胞分化相关细胞因子MCP-1及M-CSF浓度。测得对照组MCF-7细胞培养上清及经雌二醇、雌二醇+他莫昔芬、他莫昔芬分别处理组细胞培养上清中MCP-1及M-CSF浓度分别为（31.33±2.4）、（75.37±5.5）、（41.97±5.8）、（24.5±5.33）pg/ml及（1.83±0.18）、（29.71±8.06）、（10.9±2.38）、（1.54±0.08）pg/ml，不同处理组MCP-1及M-CSF浓度差异具有统计学意义（P＜0.05）。雌二醇可增强MCF-7细胞分泌MCP-1及MCSF的能力，而他莫昔芬可部分阻断该效应，见表1。

表1 细胞因子芯片检测雌二醇及他莫昔芬对MCF-7细胞培养上清中M-CSF及MCP-1的影响Table1 Theeffect of estradiol and tamoxifen on M-CSF and MCP-1 in theculturesupernatant of MCF-7 cellsby cytokinemicroarray

2.2 不同处理组MCF-7细胞对共培养体系中U937细胞的诱导分化差异 不同处理组MCF-7细胞与U937细胞共培养48 h后U937细胞形态发生改变，由光滑小圆形悬浮细胞部分转变成为不规则形细胞，并有部分细胞呈现贴壁生长特性（见图1）。经RT-qPCR检测M2型巨噬细胞相关标记CD163在不同处理组中表达存在差异（见图2）。

3 讨论

图1 单核细胞株U937及其与乳腺癌细胞株共培养后细胞形态变化Figure1 Mononuclear cell line U937 and cell morphological changes after co culture with breast cancer cell lines

图2 单核细胞株U937与不同处理组乳腺癌细胞株共培养48 h后CD163的表达差异Figure2 Expression difference of CD163 after 48 h co culture of U937 mononuclear cell line and different treatment group breast cancer cell lines

雌激素在激素依赖型乳腺癌的发生和发展中起着重要作用。研究发现，雌激素主要通过与雌激素受体结合来发挥促肿瘤效应。他莫昔芬是一种常见的激素依赖型乳腺癌患者内分泌治疗药物，它通过与雌二醇竞争性结合雌激素受体，从而阻断雌激素对激素依赖型乳腺癌细胞的促进作用，可有效降低激素依赖型乳腺癌患者的复发死亡风险，因而被临床广泛用于雌激素受体阳性的乳腺癌患者[8-10]。肿瘤的进展取决于肿瘤细胞内在的生物学特性及其所处的肿瘤微环境两方面。TAMs肿瘤微环境中的重要组份，它通过促进肿瘤的生长、转移、新血管生成和瘤旁炎性反应等发挥促癌作用[11-12]。研究表明TAMs在乳腺癌组织中的丰度是乳腺癌预后的独立预测因素之一[5，13]。

本研究利用细胞因子芯片检测雌激素及他莫昔芬对激素依赖型乳腺癌细胞株培养上清中单核细胞趋化分化相关因子的表达差异，并通过共培养体系检测MCF-7细胞对单核细胞株U937的分化诱导，最后利用RT-PCR技术对诱导分化的细胞进行表型鉴定证实了雌二醇能促进激素依赖型乳腺癌细胞株MCF-7分泌MCP-1及M-CSF，从而增强其对单核细胞活化的能力，他莫昔芬可通过竞争性结合雌激素受体而发挥阻断效应。这为激素受体阳性乳腺癌通过内分泌治疗降低其复发风险提供了新的理论依据。

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