深圳某养殖场奶牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测与皮内变态反应比对试验

黄 沁

（广东省深圳市光明新区动植物检验检测中心，广东 深圳 518107）

牛结核病是一种人畜共患传染病，被我国列为二类动物疫病，给牛业生产特别是奶牛养殖业造成巨大危害，并对人类的健康也造成了严重的威胁。为加强奶牛养殖场结核病的高效监测，我实验室人员严格按照农业部发布的动物疫病监测计划，每年定期对辖区内的奶牛进行结核病检疫监控。近年来，随着全球科技的高速发展，牛结核病的检测方法也逐步完善，现行的检测方法包括结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验和γ-干扰素检测试验。其中皮内变态反应是我国标准（GB/T 18645-2002）规定的牛结核病检测方法，而γ-干扰素检测试验是OIE规定的国际贸易指定使用的检测方法，为了验证此两种方法在实际工作中的检测效果，我实验室运用两种检测方法对辖区内A,B奶牛养殖场的12月龄以上奶牛进行了检测比对试验。

1 牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

1.1 试验材料

（1）试验对象：来自A养殖场的131头奶牛，B养殖场的1505头奶牛。

（2）试验试剂：提纯牛型结核菌素，购于哈药集团生物疫苗有限公司；75%酒精。

（3）试验器材：一次性5mL的注射器，卡尺，酒精棉。

1.2 试验过程

（1）注射部位及术前处理：在牛只编号后在颈侧中部上1/3处剪毛，直径约为10cm。

用卡尺测量中央皮皱厚度，作好记录。

（2）注射剂量：用生理盐水将提纯牛型结核菌素冻干粉稀释成0.1mL/头（含20000IU）使用，一律皮内注射。

（3）注射方法：以75%酒精消毒术部，后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD，注射后局部应出现小疱

（4）试验结果的观察：皮内注射后经72h判定，观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，后用卡尺测量每头牛皮皱厚度，做好记录。

1.3 结果判定

计算出每头奶牛的皮厚差（皮厚差=反应后皮厚-原皮厚度）。阳性：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm；疑似：局部炎性反应不不明显，皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm；阴性：无炎性反应，皮厚差在2.0mm以下。

2 牛结核γ-干扰素检测试验

2.1 试验材料

牛全血。用一次性肝锂素真空管收集牛血，每管至少5mL，轻轻颠倒几次混合全血，使肝素溶解。

试剂盒。牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒，购于青岛瑞尔生物技术有限公司。

试验耗材及主要设备。微量移液枪、无菌24孔组织培养板、酶标仪、37℃培养箱试验过程。

（1）血液分装。将采集的抗凝血加入24孔组织培养液，每头动物加三孔，每孔1.5mL。

（2）加入刺刺激抗原。无菌加入100μL牛PPD、禽PPD、PBS液至相应的孔。

（3）孵育。将组织培养板放置37℃湿温培养箱中孵育16～24h。

（4）血浆样品的收获。每孔吸取400μL上层血浆转移至1.5mL离心管中。

2.2 牛γ-干扰素免疫试验

试验前将所有试剂恢复至室温，用0.5mL去离子水溶解阴阳性冻干粉，并平衡15min。加入样品：加入100μL待测样品及对照品至相应孔中。封板：室温孵育1h。洗涤4次。加入酶标结合物：每孔加入50倍浓缩酶标结合物。再次封板：室温孵育1h。洗涤4次。加入底物：每孔加入100mL底物液充分混匀。封板：室温避光孵育15min。加入终止液：每孔加入50μL终止液。终止后5min内读出OD450nm的值。

3 结果判定

（1）结果的读取及判定标准。读取每孔的OD值（注意：当进行重复孔时，OD值的计算需取平均值）

阳性=牛PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1且牛PPD的OD值-禽PPD的OD值≥0.1

阴性=牛PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1或牛PPD的OD值-禽PPD的OD值＜0.1

（2）结果的有效性。只有当阳性对照OD值大于0.700，阴性对照OD值小于0.150时该试验才有效。

4 试验结果

（1）牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验结果

A养殖场的2头奶牛呈阳性，其余均为阴性；B养殖场的8头奶牛呈阳性，其余均呈阴性。

（2）牛结核γ-干扰素检测试验结果。

针对A,B场牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应呈阳性的10头奶牛进行该实验。A养殖场的1头奶牛呈阳性，其余均为阴性；B养殖场的5头奶牛呈阳性，其余均呈阴性。

试验结果比对，见表1。

表1 试验结果比对

5 结果分析

从表1中可知，对经初检皮内变态反应的试验筛选出的阳性牛进行牛结核γ-干扰素检测试验和皮内变态反应复检试验，两试验检测符合率较低。

（1）牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

初检有2头结果呈现阳性的牛，不排除受禽型结核分枝杆菌等引起非特异性假阳性的影响；复检结果呈现0头阳性牛的情况，不排除主观肉眼观察皮皱差出现误差的影响。

综上所述：只靠皮内变态反应实验就确诊牛结核病是不科学合理理的。

（2）牛结核γ-干扰素检测试验

牛结核γ-干扰素检测试验通过用牛PPD和禽PPD分别刺刺激全血，检测各全血样品中释放的γ-干扰素的差异来判断牛结核病的阴阳性，排除了禽型结核杆菌引起的非特异性反应的情况。试验结果表明：γ-干扰素检测试验的阳性率比皮内变态反应的阳性率高，可能与皮内变态反应存在假阳性情况有关。

6 讨论

现行国家标准有关牛结核病检测方法只有结核分枝杆菌PPD皮内变态反应，但此法需肉眼观察皮皱差，主观性太强，而且受其他型结核杆菌的干扰极大，假阳性率较高。若实际检疫工作中用此法判定牛结核病，可能会有误判，会直接导致养殖场的经济利益受损。γ-干扰素检测试验，匹配相应试剂盒标准说明，当前实验室检测牛结核工作大多使用国外成熟产品，且该产品灵敏度高，具有较高的特异性，在现实操作中更简便，结果判定更直接。鉴于以上优点，γ-干扰素检测试验用于检测牛结核病较现行国标方法具有更为广阔的应用前景。