梓醇对糖尿病大鼠胰岛细胞Insulin表达的影响

，，， ， ，

随着人口老龄化以及不良生活方式的影响，糖尿病的发病率呈逐年升高的趋势。糖尿病是一种以胰岛素分泌不足或抵抗为特征的代谢障碍性疾病，如何提高胰岛素的分泌和减轻胰岛素抵抗是治疗糖尿病的关键。前期实验证实，梓醇可以降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，增加胰岛素敏感性，保护胰岛细胞[1]。本实验将进一步探讨梓醇对糖尿病大鼠胰岛细胞Insulin表达的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 健康雄性Wistar大鼠共100只，8周龄，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。高糖高脂饲料配方参照徐叔云《药理实验方法学》[2]，购自哈尔滨市博士德试剂公司。

1.2 主要试剂及仪器 梓醇、链脲佐菌素、Insulin antibody、Anti-phospho-腺苷酸活化蛋白激酶-α1(AMPK-α1)、离心机、组织包埋机、分析天平、石蜡切片机、磁力搅拌器、奥林巴斯显微摄像系统。

1.3 动物分组及干预方法 参照前期实验[1]：选取雄性Wistar大鼠，8周龄，根据随机数字表法分为正常组(10只)与实验组(90只)。实验组饲养8周高糖高脂饮食后经腹腔注射链脲佐菌素，剂量为15 mg/kg，以空腹血糖≥16.7 mmol/L作为2型糖尿病成模标准，将符合2型糖尿病成模标准的60只大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组、梓醇高剂量组。正常组和模型组灌胃蒸馏水5 mL/(kg·d)；二甲双胍组灌胃二甲双胍90 mg/(kg·d)；梓醇低、中、高剂量组分别灌胃梓醇2.5 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)。分别干预12周后，经免疫组化检测胰岛细胞Insulin的表达水平，Western Blot 检测AMPK-α1蛋白表达。

1.4 免疫组织化学法检测胰岛细胞Insulin的表达 用免疫组织化学法检测胰岛细胞中Insulin的表达。3%H2O2孵育，EDTA微波修复抗原，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，4 ℃冰箱过夜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，选用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水透明，树脂封片，显微镜下观察。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，光镜下所见黄褐色颗粒为阳性，应用HPIAS-1000型全自动图像分析系统，每组随机选取5张切片，测定阳性染色积分光密度值(integral optical density，IOD)，取其平均值作为该标本的IOD值。

1.5 Western Blot检测AMPK-α1蛋白表达水平 分离胰岛取5 mg组织，放入裂解液中裂解，在冰浴下匀浆，以4 ℃离心(10 000 r/min，10 min)，取上清液用酚试剂法测定各组蛋白浓度后，制成蛋白浓度相等的样品，取20 μL蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后电转印至硝酸纤维素膜，用3%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h，分别滴加兔抗鼠AMPK-α1抗体，于4 ℃下孵育过夜，洗膜后选择相应碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，应用碱性磷酸酶显色，并在凝胶自动成像分析系统下成像。以AMPK-α1蛋白表达作为观测指标。

2 结 果

2.1 各组Insulin表达比较 干预12周后免疫组织化学染色结果显示，与正常组比较，模型组、二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组、梓醇高剂量组大鼠胰岛细胞Insulin均表达减少。与模型组比较，二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组、梓醇高剂量组大鼠胰岛细胞Insulin表达增多，其中梓醇高剂量组、梓醇低剂量组Insulin表达与二甲双胍组比较差异有统计学意义(P< 0.01)。详见图1、图2。

A为正常组；B为模型组；C为二甲双胍组；D为梓醇高剂量组；E为梓醇中剂量组；F为梓醇低剂量组。与正常组比较，#P< 0.01；与模型组比较，＊P< 0.01；与二甲双胍组比较，△P< 0.01。

图2各组Insulin表达灰度值比较

2.2 各组AMPK-α1蛋白表达比较 干预12周后Western Blot检测结果显示，与正常组比较，其他各组胰岛细胞AMPK-α1蛋白表达均减少(P< 0.01)；与模型组比较，二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组、梓醇高剂量组胰岛细胞AMPK-α1蛋白表达增多(P< 0.01)，其中梓醇高剂量组AMPK-α1蛋白表达较二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组表达增多，差异有统计学意义(P< 0.01)。详见图3。

A为正常组；B为模型组；C为二甲双胍组；D为梓醇低剂量组；E为梓醇中剂量组；F为梓醇高剂量组。与正常组比较，#P< 0.01；与模型组比较，＊P< 0.01；与梓醇高剂量组比较，△P< 0.01。

图3各组AMPK-α1蛋白表达的表达

3 讨 论

糖尿病的主要病理基础是胰岛素分泌不足和(或)胰岛素抵抗[3]。持续高血糖可导致心、脑、肾、眼底等多种靶器官损害[4-5]。前期实验证实梓醇可以降低糖尿病大鼠血糖，增加胰岛素分泌指数，HE染色结果亦提示梓醇可保护胰岛B细胞[1]。

本实验应用免疫组织化学方法观察Insulin分泌水平，模型组大鼠胰岛细胞呈淡黄色，而梓醇各剂量组胰岛细胞胞浆呈橙黄色，经灰度值统计结果证实，梓醇各剂量组胰岛B细胞结构相对完整，Insulin表达水平明显高于模型组。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种能量调控器，由功能亚基(α)和调节亚基(β，γ)构成的异源三聚体，AMPK 参与了体内葡萄糖的代谢调节，因此，AMPK 是糖尿病病人代谢调节的关键靶点之一[6]。激活AMPK 能够促进葡萄糖的摄取、糖酵解、脂肪酸氧化并且抑制糖原合成、改善胰岛素抵抗[7-8]。AMPK分多种亚型，其中起主要作用的是AMPK-α1。为探讨梓醇增加胰岛素分泌、减轻胰岛素抵抗、降低血糖的机制，本研究应用Western Blot方法检测胰岛素细胞AMPK-α1蛋白的表达水平，结果显示，与其他各组比较，梓醇高剂量组AMPK-α1蛋白表达明显增多，从而说明梓醇是通过调节AMPK-α1蛋白的表达以促进胰岛细胞分泌胰岛素，从而发挥降低血糖的作用。

参考文献：

[1] 邹国良,仲维莉,许瑞,等.梓醇对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,15(14):1727-1729.

[2] 徐叔云,卞如濂.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2002:31-37.

[3] Huynh K,Bernardo BC,Mc Mullen JR,et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidantsignaling pathways[J].Pharmacol Ther,2014,142(3):375-415.

[4] 刘江月.梓醇对糖尿病大鼠主动脉的保护作用与抗氧化机制研究[J].中国病理生理杂志,2014,30(6):1023-1028.

[5] Jiang B,Shen RF,Bi J,et al.Catalpol:a potential therapeutic for neurodegenerative diseases[J].Curr Med Chem,2015,22(10):1278-1291.

[6] Yang M,Zhang Z,Wang C,et al.Nesfatin-1 action in the brain increases insulin sensitivity through Akt/AMPK/TORC2 pathway in diet-induced insulin resistance [J].Diabetes,2012,61(8):1959-1968.

[7] Habegger KM,Hoffman NJ,Ridenour CM,et al.AMPK enhances insulin-stimuated GLUT4 regulation via lowering membrane cholesterol[J].Endocrinology,2012,153 (5):2130-2141.

[8] Han Y,Jung HW,Park YK.Effects of icariin on insulin resistance via the activation of AMPK pathway in C2C12 mouse muscle cells[J].Can J Cardiol,2015,31(4):502-508.