气相色谱-串联质谱法测定卷烟主流烟气中7种酚类化合物

吴永良，李燕垣，彭云铁

(广东省质量监督烟草检验站，广东 广州 510610)

卷烟主流烟气中的酚类化合物主要由多酚类化合物(绿原酸和芸香苷)、木质素和纤维素在卷烟燃烧过程中热裂解生成[1]。目前，已报道的卷烟烟气中酚类物质有50多种，其中含量最高的为苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚7种酚类化合物[2]。酚类化合物对人体健康的影响常表现为两面性，既具有基因毒性和致癌作用，又具有抗基因毒性和抗癌作用[3-4]。因此，对卷烟主流烟气中酚类化合物的分析检测具有重要意义。

卷烟烟气是一个非常复杂的混合物体系，其中含有超过5 000种化合物，且酚类化合物含量很低，实现其准确定量难度较大。目前，卷烟主流烟气中酚类化合物的检测方法主要有：气相色谱法(GC)[5-6]、气相色谱-质谱法(GC/MS)[7-10]、液相色谱法(HPLC)[11-17]、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[18-20]等。传统的GC法灵敏度低，需要对样品衍生化，前处理复杂；GC/MS法得到的色谱杂峰较多，一般需要固相萃取净化样品；最常用的是HPLC法，但分析时间长，对低含量的间苯二酚定量准确性较差；HPLC-MS/MS仪器昂贵，不易普及。气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检出限低、抗干扰能力强、定性准确，适合复杂基质样品中痕量化合物的测定，目前，尚未见该方法应用于检测卷烟主流烟气中酚类化合物的报道。

本研究拟采用GC-MS/MS法检测卷烟主流烟气中的酚类化合物，希望为卷烟有害物质的分析研究提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

7890B-7000C气相色谱-串联质谱仪：美国Agilent公司产品；SM450直线型吸烟机：英国Cerulean公司产品；AG245电子分析天平(感量0.01 mg)：瑞士Mettler Toledo公司产品；KH-500DE超声波发生器：昆山禾创公司产品；HY-5振荡器：常州澳华公司产品。

卷烟样品：均来源于市售卷烟样品；44 mm剑桥滤片：英国Whatman公司产品；0.45 μm有机相滤膜：上海安谱公司产品。

苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚：纯度99.0%，美国Supelco公司产品；苯甲酸丙酯、十七烷、苯甲酸苄酯：纯度99.0%，美国Sigma-Aldrich产品；丙酸苯乙酯：纯度99.0%，Acros公司产品；环己烷、二氯甲烷、异丙醇、甲醇：HPLC级，德国CNW公司产品。

1.2 溶液配制

内标溶液：称取约0.1 mg丙酸苯乙酯，用异丙醇溶解，定容于100 mL棕色容量瓶。

一级混合标准溶液：分别称取约150 mg邻苯二酚、对苯二酚，约50 mg苯酚，约25 mg邻甲酚、间甲酚、对甲酚，约10 mg间苯二酚(精确至0.01 mg)，用异丙醇溶解，定容于100 mL棕色容量瓶。

二级混合标准溶液：准确移取10 mL一级混合标准溶液于100 mL容量瓶中，并用异丙醇定容。

标准工作溶液：分别准确移取0.1、0.2、0.5 mL二级标准溶液，0.1、0.2、0.5 mL一级标准溶液至50 mL棕色容量瓶中，再加入100 μL内标溶液，用异丙醇定容。

1.3 样品前处理

按照GB/T 16450 和GB/T 19609规定的方法捕集5支卷烟的总粒相物[ 21-22]。将捕集有总粒相物的剑桥滤片置于100 mL锥形瓶中，加入100 μL内标溶液和50 mL异丙醇萃取剂，超声提取20 min。静置，冷却至室温后，将萃取液过0.45 μm有机滤膜，然后将滤液转移至色谱分析瓶中，用于GC-MS/MS分析测定。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：氦气，恒流模式，流速1.2 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量：1.0 μL；分流比：20∶1；升温程序：从80 ℃以6 ℃/min 升至140 ℃，再以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.4.2质谱条件 EI离子源电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：多反应监测模式(MRM)；溶剂延迟：2 min；碰撞气流速：氮气1.5 mL/min，氦气2.25 mL/min。优化后的保留时间、定量和定性离子对及碰撞能量列于表1。

表1 7种酚类化合物和内标的保留时间和MRM参数Table 1 Retention time and MRM parameters of 7 phenolic compounds and ISTD

1.5 结果计算

卷烟主流烟气中酚类化合物的释放量由式(1)计算得出：

(1)

式中：m为每支卷烟酚类化合物的释放量(μg/cig)；A为萃取溶液中酚类化合物的浓度(mg/L)；V为萃取溶液的体积(mL)；n为每次测试抽吸卷烟的支数(cig)。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1提取剂及用量的选择 提取剂是影响提取效率的关键因素，提取剂与目标物的极性越接近，目标物在溶剂中的溶解度就越大，越易被提取。实验比较了环己烷、二氯甲烷、异丙醇和甲醇4种不同极性溶剂的萃取效率，结果列于表2。结果表明：环己烷提取邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚的效率较低；二氯甲烷提取苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚的效率较低；异丙醇和甲醇对各化合物的提取效率相似，但异丙醇的毒性小于甲醇，因此选择异丙醇为提取剂。

提取剂的用量至少应可浸没捕集滤片。本实验考察了20、50、100 mL 异丙醇提取剂对提取效率的影响，结果列于表3。可见，当提取剂为20 mL时，7种酚类化合物的测定结果均略低于50 mL和100 mL。综合考虑，选择提取剂用量为50 mL。

表2 不同提取剂的提取效率比较Table 2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvents

表3 不同提取溶剂量的比较Table 3 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvent volumes

图1 不同提取方式和提取时间的比较Fig.1 Comparison of different extraction methods and extraction time

2.1.2提取方式与时间的优化 本实验考察了振荡和超声2种提取方式，提取时间分别为5、10、20、30、40、60 min，提取效率示于图1。超声提取的提取效率略优于振荡提取，当提取时间达到20 min后，继续延长提取时间，提取效率没有明显变化。因此选择超声提取20 min。

2.2 色谱-质谱条件优化

2.2.1内标的选择 实验选取了烟草检测中常用的苯甲酸丙酯、丙酸苯乙酯、十七烷、苯甲酸苄酯为研究对象，考察各化合物作为内标物对检测结果的影响，结果示于图2。可见，十七烷和苯甲酸苄酯与目标物保留时间差别较大，不适合作为内标物；苯甲酸丙酯和丙酸苯乙酯与目标物保留时间较接近，且相对响应较高，可作为内标物。本实验选用丙酸苯乙酯为内标物。

2.2.2色谱柱与程序升温条件的确定 实验分别考察了弱极性的HP-5MS UI、中极性的DB-35MS和强极性的HP-INNOWAX(规格均为30 m×0.25 mm×0.25 μm)3种毛细管柱对7种酚类化合物的分离效果。结果表明，HP-INNOWAX色谱柱能够实现间甲酚和对甲酚的完全分离，但邻、间、对苯二酚的相对响应较弱；HP-5MS UI和DB-35MS色谱柱均不能实现间甲酚和对甲酚的完全分离，但各酚类化合物的峰形较好、相对响应较强，DB-35MS色谱柱目标物保留时间比HP-5MS UI更长。因此，选取HP-5MS UI色谱柱为分析柱。

实验中优化后的升温程序为：从80 ℃以6 ℃/min升温至140 ℃，再以20 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。在该条件下，仅间甲酚和对甲酚不能得到有效地分离，其余各物质均能较好地分离，且出峰较快，结果示于图3。由于间甲酚和对甲酚不能完全分离，本实验将二者的释放量合并计算。

2.2.3质谱条件的确定 首先采用全扫描(Scan)模式确定内标物和目标物的母离子，然后采用产物离子扫描(Product ion analysis)模式优化碰撞能量及产物子离子，对每组母离子/子离子分别选择碰撞能量为5、10、15、20、25、30、35、40 V进行扫描，选择子离子响应最强的碰撞能量，在此基础上进行微调，得到最优碰撞能量。最后采用MRM模式对内标物和目标物进行定性、定量分析。优化后的质谱条件列于表1。

2.3 分析方法评价

2.3.1工作曲线、检出限与定量限 在优化条件下，对酚类化合物标准溶液进行GC-MS/MS测定，得到线性回归方程和相关系数，分别以3倍和10倍信噪比确定检出限(LODs)和定量限(LOQs)，结果列于表4。结果表明，化合物的相关系数均在0.998 6以上，线性关系良好；定量限为0.012～0.021 μg/cig。

2.3.2回收率和精密度 选择烤烟型和混合型卷烟样品各1个，将7种酚类化合物的3种浓度标准溶液加入样品捕集后的滤片中，进行加标回收率实验，每个添加水平重复5次，并进行6次日内和5次日间的平行测定，结果列于表5。该方法的回收率为91.1%～107.7%，平行测定的相对标准偏差(RSD)为2.5%～6.6%，表明该方法具有良好的精密度。

表4 7种酚类化合物的线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of 7 phenols

表5 方法的加标回收率和精密度Table 5 Spiked recoveries, intra-day and inter-day precisions of the method

续表5

2.4 实际样品测定

按照本方法与标准方法[23]分别测定了1R5F、3R4F和CM7等3个参比卷烟主流烟气中7种酚类化合物的释放量，结果列于表6。通过比较发现，2种方法的测定结果一致，但相比标准方法，本方法具有分析时间短、检测限低等优点。

应用本方法检测12个不同品牌规格卷烟样品主流烟气中7种酚类化合物，结果列于表7。可见，不同品牌卷烟烟气中酚类化合物的释放量存在较大差异，酚类化合物同焦油释放量成正相关；混合型卷烟的苯酚释放量一般低于烤烟型卷烟；相同焦油量卷烟的酚类化合物释放量差异也较大，主要是由不同的叶组配方、卷烟辅材、加工工艺等造成的。

表6 2种方法检测参比卷烟主流烟气中7种酚类化合物的释放量Table 6 Comparison of 7 phenols content of 3 cigarette samples under different methods

表7 部分市售卷烟主流烟气中7种酚类化合物的释放量Table 7 Contents of 7 phenols in the mainsteam smoke of the cigarette samples sold in the market

3 结论

建立了卷烟主流烟气中苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚7种酚类化合物的GC-MS/MS检测方法。通过优化前处理和仪器条件，方法定量限为0.012～0.021 μg/cig，加标回收率为91.1%～107.7%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～6.6%。该方法的重复性和回收率良好、定量限低、操作简单、分析时间短，适用于大批量卷烟样品主流烟气中酚类化合物的快速定量检测。

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