云南文山州首次在感病西葫芦上检测到番木瓜环斑病毒

孙媛　卢建霖　唐桂清　张全财　高伟　李文跃

摘要

为明确引起云南文山州广南县西葫芦发生蕨叶、斑驳、泡状斑等症状的病原，从采集的西葫芦病样中提取总RNA，利用RTPCR扩增后经电泳检测及测序获得大小为887 bp的片段；经过BLAST序列同源性比对分析，该病原与番木瓜环斑病毒Papaya ringspot virus（PRSV）（KY996464）基因序列同源性达87%。由此可知，侵染文山州西葫芦的病毒病原是番木瓜环斑病毒。

关键词

西葫芦； 检测； 番木瓜环斑病毒

中图分类号：

S 432.41

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017350

First detection of Papaya ringspot virus on Cucurbita pepo in

Wenshan State of Yunnan Province

SUN Yuan， LU Jianlin， TANG Guiqing， ZHANG Quancai， GAO Wei， LI Wenyue

（Plant Protection and Quaratine Station in Wenshan State， Yunnan 663099， China）

Abstract

In order to confirm the pathogen of zucchini showed fern leaf， motley and bubble spot symptoms in Guangnan County， Wenshan State， Yunnan Province， the RNA was extracted from the collected samples， and the pathogen was detected using RTPCR. An 887 bp fragment was amplified and sequenced. The results of BLAST analysis showed that the sequence has high homologous （87%） with that of Papaya ringspot virus （PRSV）. Therefore， the pathogen causing the disease of zucchini in Wenshan State is Papaya ringspot virus （PRSV）.

Key words

Cucurbita pepo； detection； Papaya ringspot virus

西葫芦Cucurbita pepo L.，也称美洲南瓜，在云南大部分地区俗称小瓜，原产北美洲南部，自19世纪中期由欧洲引入我国，现在我国各地已有较多品种广泛种植，统计入库的西葫芦种质资源已达398份 [1]。

2017年5月在田间病害调查中发现云南文山州广南县种植的西葫芦出现叶片褪绿、畸形、蕨叶，同时果实也出现褪绿、斑驳、表面不平整、形成凸起泡状斑等一系列症状，通过采集具有典型症状特征的发病西葫芦植株，采用EZNA Plant RNA Kit提取总RNA，利用RTPCR技术对病样进行检测和鉴定，结果表明引起广南县西葫芦感病的病原物为番木瓜环斑病毒Papaya ringspot virus （PRSV），这是文山州首次发现番木瓜环斑病毒侵染西葫芦。

1 材料与方法

1.1 病样采集

在文山州广南县田间病害调查中观察到西葫芦出现疑似病毒病的症状，对田间发病症状拍照并采集症状明显的3株病样，用于病原检测、鉴定。

1.2 病原RTPCR检测

提取样品总RNA，采用RTPCR检测病原。首先利用EZNA Plant RNA Kit获得样品总RNA，利用下游引物M4T逆转录合成cDNA第一链[2]。扩增总体系为20 μL，反应体系如下：总RNA 4 μL，下游引物M4T 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Free ddH2O 2.5 μL，混合均勻，65℃水浴5 min，迅速置于冰上急冷30 s，加入5×Prime ScriptⅡ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime ScriptⅡ RTase 1 μL，RNase Free ddH2O 4.5 μL；反应条件：42℃，90 min；72℃，15 min。利用2×Power Taq PCR Master Mix试剂盒，以cDNA产物为模板，用马铃薯Y病毒科特异性引物Sprimer/M4进行PCR扩增[3]，扩增总体系为50 μL，反应体系如下：2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，上游引物Sprimer 1 μL，下游引物M4 1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL，混合均匀；扩增程序：94℃，3 min；94℃，30 s，56℃，60 s，72℃，120 s，30个循环；72℃，10 min，4℃保存备用，PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 病原鉴定

将检测到有条带的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，得到的测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，鉴定病毒种类。

2 结果与分析

2.1 发病症状

文山州广南县西葫芦出现叶片褪绿、畸形、蕨叶等症状，果实也出现褪绿、斑驳，表面不平整，形成凸起泡状斑，如图1所示。

2.2 电泳检测及序列分析

经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约800 bp的明显条带（图2），测序结果为887 bp。将测序得到的序列与GenBank数据库中序列进行比对，结果表明，该病原序列与番木瓜环斑病毒Papaya ringspot virus （PRSV）（KY996464）基因序列同源性达87%。综上，利用RTPCR检测及序列同源性比对分析确定侵染西葫芦的病毒是番木瓜环斑病毒。

3 讨论

笔者在云南文山州广南县调查发现西葫芦出现疑似病毒病感染的症状，对具有典型症状的病样进行RTPCR扩增检测，将测序得到的序列与GenBank数据库中已知序列进行比对分析，表明广南县西葫芦表现褪绿、畸形、蕨叶、泡状斑症状的病样中含有番木瓜环斑病毒Papaya ringspot virus，这是文山州首次在西葫芦上检测到番木瓜环斑病毒。PRSV最早在美国报道，随后日本、印度、澳大利亚、巴西等国家均有报道，在我国海南、台湾、广州、广西、福建等地区也有报道。该病毒在云南普遍发生，昆明、玉溪、楚雄、红河、临沧、德宏、保山等地区均有报道[48]。葫芦科作物作为世界重要食用植物之一，在农业生产中占有重要地位，然而对于西葫芦病毒病的报道相对较少，人们对病毒感染西葫芦的症状识别、鉴定及防治上的了解存在一定的局限。西葫芦一旦感染病毒病，其损失十分严重。PRSV是马铃薯Y病毒属成员，除侵染番木瓜外，主要侵染葫芦科植物，给农业生产带来严重损失，因而如何有效开展防治工作成为农业生产急需突破的关键。目前尚不清楚文山州广南县发生PRSV的传染源、传播途径及寄主范围，后期应进一步开展关于PRSV侵染、传播、致病、寄主抗性等方面的研究，以指导抗病品种选育及构建新种质资源库，为防治番木瓜环斑病毒病提出有效措施。

参考文献

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[3] CHEN J， CHEN J， ADAMS M J. A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae， and its use to examine the taxonomic status of several members of the family [J]. Archives of Virology， 2001， 146（4）：757766.

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（责任编辑：杨明丽）