利用GBS技术开发烟草SNP标记及遗传多样性分析

蔡露 杨欢 王勇 李廷轩 陈光登

摘 要：研究烟草种质资源的遗传背景，为烟草种质资源的高效利用提供依据。采用GBS（genotyping-by-sequencing）技术，挖掘92份烟草种质资源的SNP位点，并进行遗传多样性和遗传结构分析。结果表明，测序共获得了147.165 Gb数据，平均每个样本1.599 Gb，筛选后共获得93 685个高质量的SNP位点；不同地理来源烟草群体等位基因数（Na）为1.27～1.93，观测杂合度（Ho）变化范围为0.22～0.76，期望杂合度（He）为0.32～0.59，多态性位点数（PLN）范围为15 877～44 249，多态性位点比率（PPL）为26.61%～74.17%，遗传多样性指数（H）为0.19～0.52，遗传距离（GD）为?0.0148～0.3849。基于遗传距离的NJ聚类将材料划分为两个类群；群体遗传结构分析表明，本研究所用材料基于模型可划分为4个亚群。通过GBS技术得到的测序数据量较大且质量较高，群体多态性较高，整体遗传多样性偏低，群体结构划分与种质来源不完全相关。

关键词：烟草；GBS；SNP；遗传多样性；遗传结构

中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2018）05-0017-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.003

Abstract： To understand the diversity and genetic structure of tobacco germplasm resources and provide an important theoretical foundation for resource use， GBS （genotyping-by-sequencing） technology was used to discover SNP loci for 92 tobacco germplasm resources. With the SNPs genotyping data， the genetic diversity and genetic structure were analyzed. By using GBS， a total of 147.165 Gb of sequences was generated from the 92 tobacco germplasms， and each sample produced 1.599 622 Gb in average. After being screened， a total of 93 685 of high-quality SNP sites was retained. The range of number of alleles （Na） for different geographic sources of tobacco population was 1.27-1.93. The observed heterozygosity （Ho） was 0.22～0.76. The expected heterozygosity （He） was 0.32-0.59. The number of polymorphic loci was 15 877-44 249. The percentage of polymorphic loci （PPL） was 26.61%-74.17%. The genetic diversity index （H） was 0.19-0.52. The genetic distance （GD） was ?0.0148-0.3849. The genetic distance-based NJ clustering was used to classify the materials into two groups. The results of the population structure based on a model-based method indicated that these materials could be divided into four subgroups. In summary， the sequencing data obtained by GBS technology provide an effective and high feasible approach to assist the genotyping of 92 tobacco accessions with high population polymorphism and low genetic diversity abundance. The division of population structure was not completely related to the geographic origin of the germplasm.

Keywords： tobacco； GBS； SNP； genetic diversity； population structure

烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物之一，作为世界上最大的烟草生产国，我国烟草育种面临亲本匮乏、品种遗传背景狭窄、盲目性、重复性大等问题[1]。种质资源是烟草资源创新和遗传育种的物质基础，遗传多样性评价可将资源有效用于种质创新和品种选育[2]。目前对烟草种质资源除利用表型特征进行鉴定外[3]，分子标记技术和基因测序技术也得到了广泛应用[4-5]。目前应用于烟草中的分子标记主要包括AFLP[6]、SSR[7]、ISSR[8]、DarT[9]和SRAP[10]等，并用于烟草种质遗传多样性分析[11]、遗传图谱构建[12]、QTL分析[13]等方面。但这些标记技术因具有通量小、精确性低、成本高及不能在基因组上广泛分布等特点限制了其进一步发展与应用[14]。SNP是在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，相较其他分子标记具有多态性好、能在全基因组上广泛均匀分布的特点，并且随着高通量测序及生物信息学数据分析技术的发展，可完成大规模自动化检测[15]。GBS是在第二代测序基础上发展的简化基因组测序技术，利用酶切加标签的方法，通过测序可获得酶切位点附近基因序列信息，进而检测大量高准确性的SNP变异信息[16]，对了解种质资源的遗传背景和系统演化，研究群体亲缘关系及群体结构具有重要意义[17]。本研究以92份烟草种质为材料，采用GBS技术挖掘SNP标记，并进行遗传多样性及遗传结构分析，为烟草种质资源的高效利用及育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验用烟草种质资源92份（表1），种子由四川省烟草公司凉山州公司提供。

1.2 研究地点与方法

1.2.1 试验地点 四川农业大学教学科研农场。

1.2.2 培养方法 煙草种子于漂浮盘中育苗，待幼苗长至7～8片叶时，每份烟草品种选择生长一致的4株取幼嫩叶片，混合取样，放入液氮罐中保存待用。

1.2.3 基因组DNA提取和GBS文库构建 取约1 g的嫩叶进行研磨，依照TaKaRa MinBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（宝生物工程大连有限公司）试剂盒法提取基因组DNA。经浓度及纯度检测后的高质量DNA用于GBS文库构建和测序。首先应用限制性内切酶对基因组进行酶切，加上带有条形码的接头后，对每个样品进行扩增，然后对样品进行混合，电泳回收350～400 bp区间的DNA条带，纯化后产物用于测序，测序反应在Illumina HiSeq 150测序平台上进行双末端150 bp的测序。

1.2.4 SNP鉴定 采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序将测序获得的高质量序列匹配到参考基因组（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term

=common+tobacco%5Borgn%5D）；利用Samtools软件进行群体SNP检测；采用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，对获得的SNPs进行过滤；通过ANNOVAR软件对SNP检测结果进行注释。

1.2.5 遗传数据分析 利用POPGENE version 1.32计算平均等位基因数（Number of alleles， Na）、观测杂合度（Observed heterozygosity， Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosity， He）、多态性位点数（Number of polymorphic loci， PLN）、多态性位点比率（Percentage of polymorphic loci， PPL）、遗传多样性指数（H）及遗传距离（Genetic Distance， GD）；运用TreeBest软件计算距离矩阵，通过邻接法（neighbor-joining method）构建NJ聚类；采用FRAPPE软件分析群体的遗传结构；利用SPSS 22.0进行相关性分析。

2 结 果

2.1 测序质量

通过GBS测序，92个烟草样本共产生147.165 Gb的总测序数据量，去除低质量的序列后，高质量序列数据量为147.130 Gb，平均每个样本为1.599 Gb。测序质量较高（Q20≥94.69%、Q30≥86.87%），GC分布正常，群体样本与参考基因组的平均比对率为99.62%，本试验的样本与参考基因组有极高的相似性。序列至少有一个碱基的平均覆盖度为6.51%，至少有4个碱基的平均覆盖度为2.47%。利用Samtools软件检测后共获得942 697个SNP位点，经过条件为测序深度2×、Miss0.3、次要等位基因频率（MAF）>0.01的过滤后，最后共获得93 685个高质量的SNP位点。对这些高质量SNP进行群体SNP注释（图1），发现SNP标记最多位于基因间区（Intergenic），约占总量的92.02%，3.48%位于基因中内含子区域（Intronic），1.61%位于基因中外显子区域（Exonic），1.50%和1.37%分别位于基因的上游（Upstream）和下游（Downstream），位于基因上游1 kb区域同时又位于另一基因下游1 kb区域（upstream/downstream）的占0.02%，位于剪切位点（Splicing）的最少，占0.01%。

2.2 遗传多样性分析

2.2.1 遗传多样性度量指标 将供试烟草材料按照地理来源划分为8个群体：加拿大群体、美国群体、福建群体、贵州群体、河南群体、山东群体、四川群体和云南群体，各自包含3、18、2、9、9、11、10、13份材料。由表2可知，各不同地理来源烟草群体的Na为1.27～1.93，平均有1.76个等位基因；He值在0.32～0.59，平均值为0.39；Ho差异较大，范围在0.22～0.76，平均值为0.33，与He值相差不大；PLN范围为15 877～44 249，平均值为38 011.38；PPL在26.61～74.17%，平均多态性位点比率为63.72%；H变化范围为0.19～0.52，不同地理来源烟草群体的遗传多样性差异较大，由高到低依次为山东群体（0.52）、加拿大群体（0.48）、云南群体（0.45）、四川群体（0.43）、美国群体/河南群体（0.41）、贵州群体（0.40）、福建群体（0.19），H平均值为0.41，整体遗传多样性较低。其中，云南群体的Na最高，但Ho最低；福建群体的Ho及He最大，而Na、PLN、PPL及H均最低；四川群体的PLN及PPL最高；而遗传多样性以山东群体最为丰富。对不同地理来源烟草的样本数及遗传多样性指标进行相关性分析（表3）发现，样本数与Na、Ho、He等3个遗传多样性指标呈显著相关，并且6个遗传多样性指标之间均呈显著相关关系。

2.2.2 遗传距离矩阵 由表4可知，8个不同地理来源烟草群体间的遗传距离GD值为?0.014 8～ 0.384 9，群体间的遗传距离不大，供试群体整体的遗传分化较小，遗传基础较为狭窄。河南群体与其他各不同地理来源的群体资源遗传距离均较近，GD值范围在0.043 1～0.192 6，说明河南群体与各群体的亲缘关系很近；而福建群体与其他群体遗传距离均较远，GD值范围在0.192 6～0.384 9，其中，福建与贵州群体间的GD系数最大，表明其遗传距离最远，遗传相似度最低。加拿大群体与云南群体及山东群体的遗传距离为负值，可能是由于群体内的遗传差异大于群体间的差异所致。总的来看，遗传距离与地理来源上的距离并无显著关联，地理来源间的距离不能单纯地判断种质间遗传距离，只能作为地理距离上的划分和遗传距离上判断的参照。

2.3 遗传结构分析

2.3.1 基于遗传距离的NJ聚类分析 由供试材料的NJ聚类（图2）来看，基于遗传距离的聚类分析92份烟草种质可以划分为2个大的类群，各类群又可进一步分为小的亚群。总的来看，相同地理来源种质在2个大的类群中存在相对聚合的现象，但在小的亞群中分布较为混杂，相同地理来源的种质并未完全归并到一处。其中，类群I中主要包括了来自福建、山东、河南及未知来源地的烟草资源，而美国、贵州及四川烟草资源主要聚类在类群II中，加拿大和云南烟草资源则在两个类群中分布较为杂乱。说明了不同地理来源的烟草种质资源之间存在一定的地理隔离，但基于遗传距离的聚类与其地理来源并无必然联系。

2.3.2 基于模型的遗传结构分析 对92份烟草材料进行Structure分析（图3），假定供试材料的群体数目（K）为2～8，根据最大似然值进行最佳K值的估算。当K=4时，由ln P（D）求出△K值最大，基于此将供试烟草种质划分为4个亚群，亚群中部分种质包含了2或3种遗传背景，说明亚群间存在一定程度的基因交流。如表5所示，亚群1中包含材料最少，共10份材料，占10.9%；亚群2中材料份数最多，包括39份，占42.4%；亚群3含13份材料，占14.1%；亚群4占32.6%，包括30份材料。其中，亚群2中包含了全部的福建种质，来自美国、加拿大、四川、河南及云南的种质大部分划分在亚群2和亚群4中，而贵州和山东的种质则大部分分布在亚群1和亚群2，亚群3包含材料较少并且材料来源较为杂乱。

3 讨 论

GBS是一种适用于高多样性物种的简便基因分型方法[18-19]，目前应用该方法已对玉米[20]、紫花苜蓿[21]、柑橘[22]等物种进行了群体SNP的检测并用于遗传图谱的构建、关联分析及遗传多样性分析等研究。ZHOU等[20]采用GBS技术，对314株玉米高世代群体（RILs）进行双末端PE125低深度测序，基于SNP基因分型结果，开发获得多个bin标记并构建了玉米高密度遗传图谱。YU等[21]利用GBS技术对179个紫花苜蓿品系进行测序，并结合表型性状进行全基因组关联分析，得到10个与黄萎病性状显著相关的SNP标记。王小柯等[22]对240份宽皮柑橘进行GBS测序，基于获得的高质量SNP位点建立的系统演化树对供试材料进行了准确的划分，并且与植物形态学的划分结果高度吻合。目前GBS技术在烟草中报道较少，肖炳光等[5]通过基因组简约法对166个DH株系烤烟测序并结合生物信息学分析获得1015个高质量SNP位点，与其他标记整合后绘制了高密度烤烟遗传连锁图谱。本研究通过GBS技术对92个烟草样本进行测序，产生的高质量序列数据量为147.130 Gb，共获得93 685个高质量的SNP位点用于后续遗传多样性分析。

遗传多样性是指种内不同群体或个体间的遗传多态性程度。目前，研究者们利用各种分子标记技术已对烟草种质资源的遗传多样性与亲缘关系进行了较多探讨。MOON等[23]利用70对SSR引物对702份收集来自全球的烟草种质资源进行了遗传多样性分析，其Na为2～41个，检测出的等位基因数目较多，基因多样性变化范围为0.123～0.949，平均0.736，基因的多样性水平较高，供试烟草种质资源遗传多样性极其丰富。张铭真等[24]对81份烟草种质材料进行遗传多样性分析，Ho平均值为0.354 5，He平均值为0.542 5，H为0.539 1，供试烟草种质的遗传多样性也相对较为丰富。而FRICANO等[25]利用49个SSR标记对源自世界各地的312份烟草种质资源进行遗传多样性分析发现，Na范围为3～13个，等位基因数目相对较少；基因多样性变化范围为0.013～0.841，基因的多样性水平较低，材料间的亲缘关系较近、遗传背景较为相似；刘艳华等[26]利用SRAP标记对81份烟草种质进行遗传多样性分析，共扩增出123个多态性位点，PPL为75.5%，群体内H为0.04～0.41，供试材料的遗传多样性不高。与MOON等[23]和张铭真等[24]不同，而与FRICANO等[25]和刘艳华等[26]的研究结果相似，本研究中不同地理来源烟草群体的Na为1.27～1.93，Ho为0.22～0.76，He为0.32～0.59，PPL为26.61%～74.17%，H变化范围为0.19～0.52。说明本研究供试烟草种质的多态性较高，但等位基因数较少，整体遗传多样性较低。不同地理来源群体间的GD范围为?0.014 8～0.384 9，供试烟草群体间的遗传距离较小，说明材料间亲缘关系较近，遗传基础较为狭窄，需引入新的种质资源以进一步拓宽遗传多样性。

利用分子标记分析群体遗传结构的研究中，聚类方法主要有2种：一种是距离聚类法，通过计算两两群体（个体）间的遗传距离，并基于遗传距离运用NJ或UPGMA算法构建聚类图；另一种是模型聚类法，通过设置参数模型运用最大似然法或贝叶斯法等标准算法推断群体或个体所属类别，再据此推断群体遗传结构及群体间的亲缘关系[27]。XIA等[28]对我国78份栽培烟草品种进行群体结构预测，通过UPGMA聚类分析和遗传结构Structure分析，两种聚类分析结果一致，均将供试材料划分为晒烟和烤烟两个亚群。童治军等[29]通过群体遗传结构分析将231份供试材料划分成3个亚群，而通过UPGMA进行聚类分析时，基于遗传距离则将烤烟材料聚为4大类，两者分类结果不同。由于两种聚类分类依据的不同，作者认为根据Structure软件划分为3个群体较为准确。本研究中基于遗传距离的NJ聚类分析将92份材料划分为两个大的类群，相同地理来源的烟草并未完全聚在一起，这与以往的研究结果[29-31]相一致，说明烟草种质间的遗传差异并不完全与地理来源相关。基于模型的遗传结构分析则将所有材料划分为4个亚群，与NJ聚类分析结果有较大差异，这与童治军等[29]研究结果相似。为避免人为因素对群体划分的影响，本研究认为基于模型将供试材料分为4个亚群具有较高的准确性。

4 结 论

本研究利用GBS技术对92份烟草种质资源进行测序，共产生147.165 Gb测序数据，经筛选过滤获得93 685个高质量的SNP位点用于遗传多样性和遗传结构分析。基于模型的遗传结构分析发现供试烟草存在4个亚群结构，亚群间存在一定程度的基因交流；基于遗传距离的NJ聚类将供试烟草划分为两个大的类群，相同地理来源的烟草种质在类群划分中存在相对聚合现象，但群体结构的划分与种质来源不完全相关；供试材料整体遗传多样性偏低，遗传变异较小。

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