雨生红球藻培养基筛选及诱导条件优化

柳科欢 白欢 马力 兰利琼 卿人韦

摘要 [目的]筛选出利于实验室来源的雨生红球藻营养生长的培养基，优化雨生红球藻内虾青素的积累条件。[方法]选用7种培养基对4株雨生红球藻分别进行培养，筛选出最适于4种藻株营养生长的培养基。探究雨生红球藻在光胁迫、高盐、缺氮3种条件下诱导虾青素积累情况。[结果]4个不同雨生红球藻藻株在配方A培养基中的生物量比其他6种试验培养基的生物量高1.65～7.30倍；在优势培养基配方A中，HP3的生物量最大，可达7.13×106 个/mL；HP3在缺氮的胁迫条件下，虾青素产量最高，可达21.05 mg/L，比光诱导获得的最佳虾青素产量高1.07倍，比高盐获得的最佳虾青素产量高1.64倍。[结论]该研究中最适于试验藻株营养生长的培养基是配方A，当胁迫条件为缺氮10%时虾青素积累量最大。

关键词 雨生红球藻；虾青素；培养基筛选；胁迫条件

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0013-04

Medium Optimization and Inducing Conditions Optimization of Haematococcus pluvialis

LIU Kehuan1 ，BAI Huan2，MA Li1 et al

（1.College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu，Sichuan 610064；2. Electric Power Research Institute of Sichuan Electric Power Company， Chengdu，Sichuan 610072）

Abstract [Objective] Medium for culturing Haematococcus pluvialis originated from laboratory was screened， accumulation conditions of astaxanthin in Haematococcus pluvialis were optimizated .[Method] Seven culture mediums were used to cultivate four kinds of Haematococcus pluvialis， 4 kinds of mediums were obtained. Astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis were exposed under lightinduced， highsalt， and nitrogendeficient respectively. [Result]Biomass about four strains algae in the formula A medium was 165-7.30 times of that in the other six mediums， HP3 gained the largest biomass in formula A， the maximum biomass was up to 7.13×106 cell/mL. Under nitrogen deficiency condition， the astaxanthin production was up to 21.05 mg/L， this number was 1.07 times of the best astaxanthin yield obtained by light， and 1.64 times of the maximum astaxanthin yield obtained by high salt. [Conclusion] The most suitable Haematococcus pluvialis medium was formula A and the regnant astaxanthin accumulation condition was 10% in this study.

Key words Haematococcus pluvialis；Astaxanthin；Medium optimization；Stress conditions

基金项目 四川省科技厅项目（2014JY0171）；四川省电科院项目（13H1138）。

作者简介 柳科欢（1994—），女，贵州兴义人，硕士研究生，研究方向：藻类分类及资源利用。

*通讯作者，副教授，博士，从事藻类学及能源微藻油脂代谢领域研究。

收稿日期 2018-07-17

虾青素（3，3-二羟基-β，β-胡萝卜素-4，4-二酮）是一种次生类胡萝卜素，具有一个多烯链，链两端各接一个β环，每个β环上又各含有一个羟基和一个酮基，13個共轭双键与单键交替存在于虾青素结构中，这赋予了虾青素强抗氧化能力，可中和细胞内自由基和清除细胞内活性氧[1-3]，虾青素的这种特性使得其被广泛应用于医学、水产、农业、化妆品等多个行业。目前，市场上的虾青素95%以上是化学合成，只有不到1%是藻类来源[4-6]。合成虾青素存在食品安全、环境污染和产品活性低等问题[5，7-8]，所以相对于合成虾青素而言，天然虾青素有更好地发展前景。雨生红球藻被公认为自然界中最具商业价值的天然虾青素来源。雨生红球藻中虾青素的生物合成和积累需在胁迫条件下进行，然而胁迫条件并不利于藻株的营养生长，所以现在通过雨生红球藻生产虾青素在工业上是通过2个步骤来进行，即先进行雨生红球藻绿色营养细胞生长积累藻类生物量，然后进行雨生红球藻胁迫积累虾青素。

雨生红球藻绿色营养生长时期的生物量决定虾青素的总产量，所以雨生红球藻培养条件的探索，依然是利用雨生红球藻生产虾青素这一领域的重要课题。一些报道显示，普通的微藻无机培养基不利于雨生红球藻生物量的大量积累，雨生红球藻绿色营养细胞的高产需要在有机培养基中实现[9]。雨生红球藻对培养基中的pH变化比较敏感，培养过程中培养基成分不断消耗，藻细胞代谢物持续产生，培养基中的pH发生变化，进而限制藻的生物量。目前已有研究证明，在藻种培养过程中向培养液中通入1%～2%的CO2（CO2/air），可有效解决由pH变化和营养物消耗引起的藻细胞生长受限的问题[10]，实际操作中基于通气过程中气体流失的考虑，通气量需高于理论值。

雨生红球藻在胁迫过程中，尤其是胁迫前期，藻中积累的虾青素含量很低，不易直接测定。雨生红球藻在胁迫条件下，其细胞内初级类胡萝卜素转化为次生类胡萝卜素（主要是虾青素，其占总类胡萝卜素的80%～99%），总类胡萝卜素含量明显增加[11-12]，所以可通过测定雨生红球藻中总类胡萝卜素变化量来侧面反应虾青素积累情况。

为了筛选出最适于试验藻株营养生长的培养基，以提高藻中虾青素的产量，该研究选用7种雨生红球藻培养基（BBM、OHM、改良MCM、配方A、BG11、BG11-1、BG11-21），对HP1、HP2、HP3、HP4 4株雨生红球藻藻株进行比较培养。再利用筛选出的优势培养基和在优势培养基中长势最好的藻株，研究不同光照强度、高盐、缺氮胁迫条件下虾青素的积累情况。

1 材料与方法

1.1 试验藻种和基本培养条件

试验藻种雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）HP1、HP2、HP3、HP4，是通过分离纯化、长期保存的藻株。

1.2 培养基筛选时期的培养条件

雨生红球藻培养条件：初始接种量为2.00×104 个/mL，培养温度为（24±1）℃，光照强度为1 500～1 800 lx，光照周期是12 h/12 h（光/暗），通气条件为4%（CO2/air，v/v），在500 mL三角瓶中盛装400 mL培养基。每个试验做3瓶平行对照，每瓶每次取2个样测定参数。

1.3 虾青素胁迫时期的培养条件和胁迫条件的设定

利用配方A培养基培养HP3藻株，基本培养条件为：温度（24±1）℃，光照强度1 500～1 800 lx，光照周期12 h/12 h（光/暗），通气量4%（CO2/air，v/v），培养规模是1 000 mL三角瓶培养700 mL藻液。HP3在配方A中培养15 d后，藻液经4 000 r/min离心10 min后收集藻细胞，用少量配方A培养基重悬藻细胞，将悬浮液均分转至各胁迫条件下培养，胁迫培养的接种浓度为5×105～6×105 个/mL，胁迫培养时除胁迫变量外，其他培养条件不变。

选取3个因素（光照强度、高盐和缺氮）进行胁迫研究。光胁迫研究中，光源为opple三基色（红绿蓝）、24 W，设置8 000、10 000、12 000 lx 3个光照强度的梯度；高盐胁迫研究是在10 000 lx光照强度基础上，向配方A培养基中加入不同浓度的NaAc，设置20、30、40、50 mmol/L NaAc 4个浓度梯度；缺氮胁迫研究，是在10 000 lx光照强度基础上，将配方A培养基中NaNO3（含氮4 mmol/L）的含量调整为原培养基的5%、10%、15%、20%。

每个胁迫条件做3瓶平行对照，每天取一次样进行色素含量检测，每瓶每次测2个样。

46卷27期 柳科欢等 雨生红球藻培养基筛选及诱导条件优化

1.4 色素提取与测定

取5 mL藻液，经4 000 r/min离心15 min，弃上清，再加入1 mL DMSO，混合均匀后65 ℃水浴5 min，待样品冷却至室温后，7 000 r/min离心2～3 min收集上清液，所得的沉淀用DMSO反复提取至基本无色，合并收集所得的上清液并定容到5 mL待测。

紫外分光光度计检测色素含量，用DMSO稀释待测提取液使其分光光度计读数在0.2～1.5范围，DMSO作为空白对照，分别在波长666、649、480 nm处读取数据，计算公式如下：

Cchla（mg/L）=（13.34×A666-4.85×A649）×稀释倍数（1）

Cchlb（mg/L）=（24.58×A649-6.65×A666）×稀释倍数（2）

Ccar（mg/L）=（1 000×A480-1.29×Cchla-4.85×Cchlb）/220×稀释倍数（3）

式中，A666、A649、A480分别为待测样品在波长480、649、666 nm处吸光值；

Cchla、Cchlb、Ccar分别为叶绿色a、叶绿色b、总类胡萝卜素含量。

1.5 虾青素测定方法

准确称取0.25 g NaOH加入双蒸水4.75 mL，得5%氢氧化钠溶液，待用。取藻液5 mL，经3 900 r/min离心15 min，收集沉淀，向沉淀中加入700 μL 5%氢氧化钠溶液和300 μL甲醇溶液，混匀，65 ℃水浴加热15 min除去样品中的叶绿素，待加热后的样品冷却至室温后，7 000 r/min离心2～3 min收集沉淀，用双蒸水洗涤沉淀3次，再向沉淀中加入1 mL DMSO，65 ℃水浴加热5 min，待样品冷却至室温，7 000 r/min离心2～3 min收集上清液，沉淀用DMSO重复提取至基本无色，合并收集的上清液并定容于5 mL。

用紫外分光光度計检测提取样品，DMSO为空白对照，检测波长是490 nm，虾青素含量由以下公式计算：

Cast（mg/L）=（4.5×A490×V1）/V2×稀释倍数（4）

式中，A490为待测样品在波长490 nm处吸光值；

Cast为虾青素含量；

V1、V2分别为提取所得液体体积、提取所用藻液体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选

4株试验藻种在不同培养基中的生长情况如图1所示。同一藻种在7种试验培养基中培养23 d后，各组藻生物量出现明显差异。HP1在配方A培养基中生物量最大，可达6.44×106个/mL，在改良MCM培养基中生物量最低，为1.73×106 个/mL；HP2在配方A中的生物量（5.07×106 个/mL）最大，在OHM中的生物量（2.67×106 个/mL）次之；HP3在配方A中生物量最大，为7.13×106 个/mL，是HP3在改良MCM中的7.29倍；HP4在7种试验培养基中接种培养23 d后，各种培养基及其对应的生物量情况如下：配方A（5.16×106 个/mL）、OHM（2.94×106 个/mL）、BG11-1（2.91×106 个/mL）、BG11（2.60×106 个/mL）、BBM（2.53×106 个/mL）、BG11-2.1（1.88×106 个/mL）、改良MCM（1.33×106 个/mL）。

上述结果表明，HP1、HP2、HP3、HP4 4株试验藻株筛选的优势培养基的结果一致，都显示藻株在配方A中的生物量最高。

2.2 虾青素诱导

如图2所示为HP3在不同胁迫条件下总类胡萝卜素变化。在3种胁迫条件下处理9 d，随着处理时间的延长，藻液中总类胡萝卜素呈现增长趋势。光诱导9 d后，光照强度为10 000 lx条件下藻液中类胡萝卜素含量最高，为12.10 mg/L；10 000 lx条件下，高盐胁迫9 d后，30 mmol/L NaAc条件下藻液中类胡萝卜素含量最高，达8.91 mg/L，50 mmol/L NaAc条件下藻液中类胡萝卜素含量最低，为5.87 mg/L；在10 000 lx条件下，缺氮胁迫9 d后，各梯度下总类胡萝卜素含量情况是10%（22.46 mg/L）、5%（21.35 mg/L）、15%（18.62 mg/L）、20%（14.24 mg/L）。

结果表明，缺氮胁迫下藻液中总类胡萝卜素含量，比光诱导和高盐2种胁迫条件下大。

如图3所示为HP3在不同胁迫条件处理9 d后虾青素积累情况。HP3在光胁迫9 d后，光照强度为10 000 lx时虾青素含量最高，可达10.17 mg/L；光照強度10 000 lx时，HP3在高盐胁迫9 d后，30 mmol/L NaAc条件下虾青素含量最高，为7.97 mg/L，50 mmol/L NaAc条件下虾青素含量最低，为3.16 mg/L；缺氮胁迫9 d后，各梯度下虾青素含量情况是：10%（21.05 mg/L）、5%（19.93 mg/L）、15%（16.71 mg/L）、20%（12.86 mg/L）。

上述结果表明，10 000 lx条件下，缺氮胁迫下藻液中虾青素含量以及胁迫前后藻液，比光诱导和高盐2种胁迫条件下都大，并且该结果与不同胁迫条件下总类胡萝卜素含量结果一致。

3 讨论

Choi等[13]利用OHM培养雨生红球藻获得最大藻细胞浓度为2.1×105 个/mL，吴晓娟等[14]研究数据显示，BG11培养基培养雨生红球藻可获得藻细胞浓度为2×105 个/mL，王正方等[15]对雨生红球藻培养基BG11进行优化研究，获得最大藻细胞浓度为1.7×105 个/mL，试验的培养条件下4种雨生红球藻藻株在OHM、BG11、BG11改良培养基取得最佳生物量分别是3.88×106 个/mL（HP3）、3.21×106 个/mL（HP4）、3.67×106 个/mL（HP3在BG11-1中培养取得）。对比上述对应培养基的生物量可知，该研究培养条件下获得的生物量约为上述列举数据的10倍，可能原因是在实验室适当的通气培养，更加有利于雨生红球藻绿色营养细胞生长。该研究在雨生红球藻营养生长过程中，向培养液中通入4%的CO2（CO2/Air，v/v），有效调整培养基pH的同时，还对培养基补充碳源，试验还发现通气条件能够在短期内将雨生红球藻红色孢子转化为绿色营养细胞。4株系雨生红球藻在7种试验培养基中培养23 d后，在配方A、OHM、BG11-1 3种培养基中生长情况比较好，并在配方A中取得生物量最佳，4株系雨生红球藻在配方A中的生物量约是OHM和BG11-1中的2倍。

在光合生物中，光照强度的改变可以激发雨生红球藻细胞积累虾青素，保护自身免受光氧化损伤[16-17]，但是不同微藻积累虾青素最适光照强度和光照胁迫时间存在差异[18-19]，例如，该研究中HP3在光照强度10 000 lx下胁迫9 d后，虾青素积累最高可达10.17 mg/L，陶云莹等[20]研究雨生红球藻在70 000 lx光照强度下胁迫10 d可获得虾青素量4.54 mg/L，才金玲等[21]研究雨生红球藻在14 800 lx光照强度下胁迫15 d可获得虾青素量2.88 mg/L。盐浓度对雨生红球藻内虾青素形成的影响较复杂，微藻种类以及生长环境不同，对于盐的耐受程度存在差异。高浓度乙酸钠胁迫时，乙酸根可降低藻细胞防御蛋白酶的活性，使得细胞更加依赖于虾青素的抗氧化功能[22]，从而促进藻细胞虾青素积累，但是高盐胁迫会影响藻细胞的渗透作用[23]，减少藻生物量。氮源浓度过高或者过低都会对微藻产生胁迫作用，但一般而言，微藻（尤其是雨生红球藻）中缺氮对虾青素积累量的影响要大于高浓度的氮对虾青素积累量的影响[24]。雨生红球藻培养物中氮的缺乏会抑制1，5一二磷酸核酮糖羧化酶的合成，从而影响卡尔文循环的第1个固碳反应，从而对藻细胞进行胁迫[25]。缺氮胁迫雨生红球藻积累虾青素时，氮的缺失是有限度的，缺氮到一定程度会严重降低藻种的生物量，并降低总的色素产量[16，26-27]。该研究中，光胁迫下虾青素的积累量明显低于缺氮，这是由于前者是单因素诱导，后者是双因素诱导，光和缺氮2个因子是通过不同途径对藻细胞进行胁迫的，其作用效果是叠加的[24]。光照强度10 000 lx条件下，胁迫下虾青素积累量较低，可能原因是盐浓度过高。

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