鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的表达及ELISA诊断试剂盒的研制与应用

亓丽红，黄 兵，吴家强，宋玲玲，王友令，马秀丽，于可响，刘 涛，艾 武，徐怀英

(山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250023)

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡急性高度接触性传染病，以呼吸道症状、蛋种鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠炎变化为主要特征，是目前危害国际养禽业的主要疾病之一。由于IBV血清型多，且新的血清型不断涌现，而各型间交叉保护率低，新的变异株不断出现，组织嗜性也多变，给诊断和防治带来一定困难[1-5]。

IBV含有3种结构蛋白，即纤突蛋白S、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。N蛋白占病毒总蛋白量的40%，主要作用是包裹核酸，与病毒的复制有关[6]。N蛋白还能免疫识别相关靶位，在细胞免疫和体液免疫中起作用。在进化过程中N蛋白比S1蛋白相对保守，因此我们通过对N蛋白进行表达，以此作为群特异性诊断抗原，建立了检测不同IBV抗体水平的间接ELISA诊断试剂盒。自建试剂盒选择原核表达载体pET-32 a(+)构建重组表达质粒进行融合表达并纯化，解决了IBV全病毒纯化困难的问题。检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸡传染性支气管炎血清学诊断的效率[7-10]。

1 材料与方法

1.1 病毒、试剂及药品

IBV-LC2、表达载体pET32 a、大肠杆菌BL21均为山东省农业科学院家禽研究所禽病诊断与免疫重点实验室保存。限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅤ及Trizol RNA提取试剂购自TaKaRa公司；反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂及dNTP混合物购自Promage公司；酶标HRP-羊抗鸡IgG(工作浓度为1∶3 000)购自SouthernBiotech公司；rTaqDNA聚合酶、DNA分子量标准(Marker)购自宝生物工程(大连)有限公司；IBV ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 IBV N蛋白的扩增及重组表达载体的构建

参照GenBank已公布的IBV-LC2N基因(DQ377139)序列，设计一对特异性引物，正链引物为5′-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3′(EcoRⅤ位点)，负链引物为5′-CCGTCGACACTC AAAGTTCATTCTCTCC-3′(SalⅠ位点)，扩增片段大小为1 230 bp。引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。提取核酸，进行RT-PCR。PCR循环参数为：94 ℃变性2 min后，经94 ℃ 1 min，50 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共30个循环，最后于72 ℃延伸10 min。将载体pET32 a和PCR产物进行EcoR V、SalⅠ双酶切并回收。用T4 DNA连接酶将二者进行16 ℃过夜连接，转化表达宿主菌感受态细菌BL21，37 ℃温箱培养16～20 h。挑取单菌落扩大培养，提取质粒，用EcoR V、SalⅠ进行双酶鉴定。将阳性重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。

1.3 重组表达质粒在宿主菌中的诱导表达

将鉴定为阳性的重组菌接种于4 mL LB(含100 μg·mL-1Amp)试验培养基中，待37 ℃振荡过夜，取出1 mL，离心，去上清，菌体接种于100 mL含Amp的 LB(100 μg·mL-1)培养基中。37 ℃ 200 r·min-1振荡培养至D600=0.6，加IPTG至终浓度为1.0 mmol·L-1，继续诱导培养至4 h，10 000 r·min-1离心5 min,收集菌体，加适量裂解缓冲液，于冰浴中超声破碎，10 000 r·min-1离心5 min，收集上清。加入等体积SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸3～5 min。每孔上样15 μL，进行SDS-PAGE电泳。用染色液 R-250染色，后放入脱色液中脱色。

1.4 表达产物的Western-blot检测

将表达产物进行SDS-PAGE电泳，待电泳分离后，切出含待转膜蛋白的凝胶转至硝酸纤维素膜。用含10%小牛血清的PBST洗液浸泡硝酸纤维膜，37 ℃封闭2 h。用洗液1∶100倍稀释鸡抗IBV阳性血清，将硝酸纤维素膜浸泡其中，反应1 h，洗液洗膜3次，每次5 min。加入新配置的DAB显色液，避光反应15 min。显色完成后，将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中终止显色。

1.5 表达的融合蛋白的纯化

按照His-Bind蛋白纯化柱使用说明进行表达蛋白的纯化。将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4 ℃预冷的250 mmol·L-1的KCl溶液中显色5～10 min，最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下，放入2 mL的Eppendorf管中，加少量的PBS洗涤数次，加少量的PBS，用玻璃棒将其捣细，反复冻融数次，8 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定，核酸蛋白分析仪测定蛋白浓度。经SDS-PAGE验证后将纯化后的蛋白分装放入-20 ℃保存备用。

1.6 间接ELISA最佳工作浓度及临界值的确定

用包被缓冲液将IBV N重组蛋白进行倍比稀释，包被ELISA反应板，每孔80、40、20、10、5、2.5 μg·mL-1包被ELISA反应板，IBV阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后分别作1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800系列稀释；进行间接ELISA测定。TMB底物显色，硫酸终止反应；测定光波长450 nm的D值。在最佳工作条件下，对收集的20份无IBV抗体鸡血清进行间接ELISA测定，确定阴阳性临界值。

1.7 间接ELISA的特异性、重复性试验和抗原保存期试验

用IBV-N蛋白建立的间接ELISA方法分别检测NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等阳性血清及IBV阴性血清进行交叉反应性测定，每样本2个重复。用2次包被的酶标板，检测10份IBV阳性血清和10份阴性血清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数。纯化的重组N蛋白以最佳工作浓度包被封闭后，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中4 ℃保存，后隔12个月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。

1.8 与IDEXX公司的ELISA试剂盒检测的对比

临床应用检验的样品80份。应用自制ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒同时检测送检样品，比较试剂盒的符合率。

1.9 间接ELISA方法的初步应用

将免疫雏鸡所孵出的12日龄的雏鸡分别在免疫前、免疫H120后5、9、21和28 d采血，分离血清，间接ELISA测定，分析母源抗体的消长情况。

2 结果与分析

2.1 载体的构建

阳性重组表达质粒经EcoR V、SalⅠ双酶切产生5.9 kb的载体条带和约1.23 kb的外源基因片段。并将阳性重组表达质粒命名为PET32 a-LC2-N。结果见图1。测序结果显示插入方向正确，插入片断为 1 230个核苷酸，编码410个氨基酸。推测IBV-LC2-N蛋白分子量为45.1 ku，融合伴侣分子量为20.4 ku，整个表达融合蛋白为65.5 ku。

1为EcoR V、SalⅠ双酶切质粒pET-LC2-N；2为DNA分子质量标准；3为EcoR V、SalⅠ双酶切质粒pET-LC2-N；4为DNA分子质量标准图1 pET32 a-LC2-N重组质粒酶切鉴定的结果

2.2 表达产物的SDS-PAGE与Western-blotting分析

将含有阳性重组载体的大肠杆菌在IPTG诱导下表达，产物经 SDS-PAGE检测，在大约65 ku处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致，而空载体菌诱导后，没有出现此蛋白条带(图2)。将目的蛋白进行纯化(图3)。Western-blotting分析发现该融合蛋白能与鸡抗IBV阳性血清进行反应，具有良好的免疫原性，确定了65.5 ku的蛋白为重组的N蛋白(图4)。

1为pET-32 a诱导表达4 h；2～6为pET-32 a-IBV-N-BL21诱导表达4 h；7 为蛋白质分子质量标准图2 重组蛋白的诱导表达

1为纯化的重组蛋白；2为蛋白质分子质量标准；3～6为纯化的重组蛋白图3 重组蛋白的纯化

1为重组蛋白；2为蛋白质分子质量标准；3为pET-32(+)空载体图4 重组蛋白的Western-blot 检测

2.3 间接ELISA最佳工作浓度及临界值的确定

间接ELISA方阵实验结果(表1)取阳性血清D450在1.0左右，阴性血清D450在 0.297左右，且阳性血清D450/阴性血清D450即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度，结果如表1所示。从表1～2可以看出，抗原最佳浓度为20 μg·mL-1，血清最佳稀释浓度为1∶200。

2.4 间接ELISA的特异性、重复性试验和抗原保存期的确定

用IBV-N蛋白建立的间接ELISA方法分别检测NDV、AIV、EDS-76、IBDV、ILTV等阳性血清及IBV阴性血清进行交叉反应性测定，结果均为阴性，表明该方法与上述病毒无交叉反应。用2次包被的酶标板，检测10份IBV阳性血清和10份阴性血清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数结果表明，变异系数最大为4.80%，最小为0.8%。20份血清变异系数都较小，具有较好的重复性。隔12个月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。结果显示，包被本发明的重组N蛋白保存12个月仍可用于检测。

表1 不同抗原包被量和血清稀释度对D450值的影响

注：P代表阳性血清；N代表阴性血清。

表2 不同抗原包被量和血清稀释度对P/N值的影响

2.5 自制ELISA试剂盒与中和进口IDEXX试剂盒的对比

临床应用检验的样品80份。应用自制ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒同时检测送检样品，比较试剂盒的符合率。其中自制ELISA试剂盒检出阳性血清为50份，阳性检出率为62.5%，进口IDEXX试剂盒检出阳性血清47份，阳性检出率为58.75%，2种方法的符合率为96.25%(表3)。

表3 血清样品的检测结果与IDEXX公司的ELISA试剂盒比较

2.6 间接ELISA方法的应用

用该试剂盒对雏鸡免疫 IBV H120前及免疫后5、9、21及28 d鸡的抗体滴度进行检测，免疫7 d后开始出现免疫抗体，然后抗体水平不断升高，到21 d抗体水平达到最高峰，随后抗体水平逐渐下降，28 d时抗体检测为阳性，抗体持续到28日龄(图5)。

图5 SPF雏鸡免疫后抗体的消长规律

3 小结与讨论

IBV核衣壳蛋白又称核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在细胞免疫和体液免疫中起着重要作用。体外表达的N蛋白能引起免疫应答，能使免疫鸡增速产生抗IBV抗体，可诱导鸡对IBV气管感染的免疫保护作用。用N蛋白免疫鸡后，可激活T辅助细胞，同时可增强B淋巴细胞产生抗体的能力。加上N蛋白具有高保守性，这使得N蛋白及其抗体在IBV诊断方面显示出优势。核蛋白占病毒总蛋白量大，而且核蛋白为非糖基化蛋白，由于它能检测群抗体应答，可以作为IBV群特异性诊断抗原。本研究在利用RT-PCR成功获得了IBVN基因的基础上，利用原核表达载体pET-32 a成功地表达了N蛋白，并证实了其具有良好的反应原性。以此重组N蛋白建立了N-ELISA，经特异性、重复性试验证实了建立的N-ELISA具有良好的应用价值。

通过自制试剂盒来检测免疫H120的IBV抗体消长变化，可知，在免疫7 d后，机体开始产生抗体，然后抗体水平不断升高，到21 d抗体水平达到最高峰，随后抗体水平逐渐下降，抗体持续到28 d，符合IBV弱毒疫苗抗体的消长规律，说明该试剂盒的检测结果可以适用于IBV免疫后的抗体水平检测。自制试剂盒的包被抗原区别于IDEXX的包被抗原IBV。自建试剂盒检测血清时做200稀释。IDEXX试剂盒检测样品时,血清样品是做500倍稀释，用这2种方法对80份血清样本进行检测，比较它们的检测结果发现，自建试剂盒检测D值普遍都比IDEXX试剂盒的D值高。出现这样的差异可能是由于血清稀释度不同造成的，也可能与2种试剂盒的包被抗原不同有关。通过比较实验结果表明自制试盒质量可靠，结果确实，是一种敏感、快速的临床检测方法。但自制试剂盒其成本低，可以用于大批量检测，是我们急需研制的国产同类试剂盒，以提高我国对IBV的检测水平[8,11]。

参考文献：

[1] 刘程. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR和RT-LAMP检测方法的建立 [D]. 成都：四川农业大学，2012：9-23.

[2] BANDE F, ARSHAD S S, OMAR A R, et al. Global distributions and strain diversity of avian infectious bronchitis virus: a review [J]. Animal Health Research Reviews, 2017, 18(1)：70-83.

[3] SEGER W, GHALYANCHI LANGEROUDI A, KARIMI V, et al. Prevalence of avian infectious bronchitis virus in broiler chicken farms in south of Iraq, 2014—2015 [J]. Veterinary Research Forum, 2016, 7(4)：317-321.

[4] ZANATY A, ARAFA A S, HAGAG N, et al. Genotyping and pathotyping of diversified strains of infectiousbronchitis viruses circulating in Egypt [J]. World Journal of Virology, 2016, 5(3)：125-134.

[5] HEMIDA M G, AL-HAMMADI M A, DALEB A H S, et al. Molecular characterization and phylogenetic analyses of virulent infectious bronchitis viruses isolated from chickens in Eastern Saudi Arabia [J]. Virusdisease, 2017, 28(2)：189-199.

[6] 李敏, 李俐睿, 岳建国, 等. 鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白克隆表达与免疫原性检测 [J]. 四川畜牧兽医，2017, 44(4)：24-27.

[7] MODIRI HAMADAN A, GHALYANCHILANGEROUDI A, HASHEMZADEH M, et al. Genotyping of Avian infectious bronchitis viruses in Iran (2015—2017) reveals domination of IS-1494 like virus [J]. Virus Research, 2017, 240：101-106.

[8] 王俞丹, 杨保收, 陈冰, 等. 鸡IBV鉴别诊断ELISA方法的研究 [J]. 黑龙江畜牧兽医，2016(3)：116-117.

[9] SULTANKULOVA K T, KOZHABERGENOV N S, STROCHKOV V M, et al. New oligonucleotide microarray for rapid diagnosis of avian viral diseases [J]. Virology Journal, 2017, 14(1)：69.

[10] BATRA A, MAIER H J, FIFE M S. Selection of reference genes for gene expression analysis by real-time qPCR in avian cells infected with infectious bronchitis virus [J]. Avian Pathology, 2017, 46(2)：173-180. doi: 10.1080/03079457.2016.1235258. Epub 2016 Dec 7.

[11] TSAI C T, TSAI H F, WANG C H. Detection of infectious bronchitis virus strains similar to Japan in Taiwan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2016, 78(5)：867-871.