自拟四味止血片质量标准的改进和完善＊

陈延绅，张广斌，王春燕，李明春，程艳芹

四味止血片是解放军第159医院自制制剂［济制字（2011）F15001］，由益母草、翻白草、地榆、丹参4味中药制成。具有清热利涩、解毒消炎、散瘀镇痛之功效。适用于功能失调性子宫出血与月经过多、月经痛的治疗。现行质量标准只有益母草和丹参的薄层鉴别，不能全面反映中药制剂的质量。为有效地控制四味止血片的制剂质量，该研究在其原质量标准的基础上，改进了原标准中益母草、丹参的薄层鉴别方法，增加了地榆的薄层鉴别方法。此外，用HPLC法检测了制剂中丹参素钠的含量，为制定具有可操作性、专属性强、重复性好、准确可靠的四味止血片质量标准提供了实验依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪；DV215CD型电子天平（OHAuS）；FA1604电子分析天平（上海衡平仪器仪表厂）；恒温水浴锅（余姚市亚星仪器仪表有限公司）。JM-B2102型电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；FA1604型电子分析天平 （上海衡平仪器仪表厂）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WD-9403型紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；电热恒温水浴槽（上海南阳仪器有限公司）。

硅胶G薄层板 （自制）；盐酸水苏碱对照品（110712-201312）； 益母草对照药材 （120912-201209）；地榆对照药材（121286-200402）；丹参对照药材（120923-201414）均购于中国食品药品检定研究院；丹参素钠对照品（20160302；含量：99．9%，坛墨质检）；四味止血片样品（20150317，中国人民解放军第159医院）；四味止血片（批号：2017023，20170224，20170225，自制）；阴性样品为该院自制；水为自制蒸馏水；乙腈（天津四友，一级色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC（薄层色谱法）鉴别

2.1.1 益母草［1，2］取本品 4 g，除去包衣，研细，加入70%乙醇溶液50 ml，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；取益母草对照药材5 g，按照供试品溶液的制备方法制成益母草的对照药材溶液；取盐酸水苏碱对照品适量，加无水乙醇制成每1 ml含2．5 mg的溶液，作为对照品溶液；取缺益母草的阴性样品3 g，按照供试品溶液的制备方法制成益母草的阴性对照溶液。吸取上述4种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸（10∶6∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液-三氯化铁试液（10∶1）混合溶液至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 益母草薄层鉴别图

2.1.2 地榆［1，3］取本品，除去包衣，研细，取粉末2 g，加10%盐酸的50%甲醇溶液50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液用盐酸饱和的乙醚振摇提取2次，25 ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；另取地榆对照药材2 g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；取缺地榆的阴性样品1 g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯（用水饱和）-乙酸乙酯-甲酸（6∶2∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图2。

图2 地榆薄层鉴别图

2.1.3 丹参［1，4］取本品，除去包衣，研细，取粉末5 g，加水50 ml，加盐酸调pH至2，超声处理30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，30 ml/次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；取丹参对照药材1 g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；取缺丹参的阴性样品2．5 g，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0．5∶2）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点；阴性对照无干扰。结果见图3。

图3 丹参薄层鉴别图

2.2 丹参中丹参素钠的含量测定［5-7］

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18（4．6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-2%冰乙酸溶液（5∶95）；流速 0．8 ml/min；检测波长 281nm；柱温 25 ℃；进样量10 μl。理论塔板数按丹参素钠峰计算应不低于2000。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液。精密称取丹参素钠对照品4．98 mg，置5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得丹参素钠对照品贮备液 1（995．0 μg/ml，丹参素钠含量为99．9%）。精密吸取对照品贮备液 1（995．0 μg/ml）1．0 ml，置 5 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度为199．0 μg/ml的丹参素钠对照品溶液。精密称取丹参素钠对照品23．88 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得浓度为 2．3856 mg/ml（丹参素钠含量为 99．9%）的丹参素钠对照品贮备液2。摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。（2）供试品溶液。取样品粉末约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流60 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。（3）阴性对照溶液。取缺丹参的阴性样品1 g，按照（2）项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2.3 系统适用性试验 吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各 10 μl，按 2．2．1 项下色谱条件进行测定，记录色谱峰。结果供试品溶液中丹参素钠的保留时间在8．5 min左右，样品峰与其他组分分离良好，且阴性对照无干扰。结果见图4。

图4 高效液相色谱图

2.2.4 线性考察 分别精密吸取2．2．2项下对照品溶液 1 （199．0 μg/ml）2 μl、4 μl、8 μl、10 μl、12 μl、16 μl、20 μl，注入液相色谱仪测定，记录色谱峰。 以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得丹参素钠回归方程为：Y=643．55X+8．8697，r=0．9999，n=7。 结 果 表 明 ， 丹 参 素 钠 在0．3980～3．9800 μg 范围内有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取2．2．2项下配制的对照品溶液 1（199．0 μg/ml）10 μl，注入色谱仪，重复进样6次，测定其峰面积。结果丹参素钠的RSD为0．19%，表明实验仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液 （批号：20150317），分别于 0、2、4、6、8、12 h 各进样 1 次，每次10 μl，测定其峰面积。 结果RSD为0．68%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取同一批号的样品（批号：20150317）粉末 1 g，共 5 份，按 2．2．2 项下方法，制备供试品溶液，分别进样10 μl，测定峰面积，并计算每克样品中丹参素钠的含量。结果丹参素钠平均含量为 4．9301 mg/g，RSD 为 1．66%， 表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量同一批号样品（批号：20150317）约 0．5 g，共 9 份分别精密加入丹参素钠对照品（2．3856 mg/ml）1．5、1、0．5 ml，按照2．2．2项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，依法进行含量测定，计算回收率。结果见表1。

表1 样品加样回收试验结果（n=9）

2.2.9 含量测定 取3个批次的样品1 g，各3份，按照2．2．2项下方法制备供试品溶液，依法进行含量测定，计算每1 g四味止血片中丹参素钠的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

益母草的薄层鉴别中，样品处理方法采用超声处理，方法简便，易于操作。通过多次实验，在展开剂的比例为丙酮-无水乙醇-盐酸 （10∶6∶1）的条件下，益母草的薄层点显色清晰，阴性对照无干扰。丹参的薄层鉴别中，为降低操作中的毒性危害，本实验改用二氯甲烷为展开剂，降低了操作过程中的毒害性。此外考虑丹参酮Ⅱa为脂溶性成分，制剂提取方法（水提取）提取量微，薄层鉴别特点不明显，改用丹参对照药材做对照。

为了能更好地控制四味止血片的质量，该实验在原质量标准的基础上增加了地榆的薄层鉴别项目。本修订中开始以没食子酸和地榆药材做对照，但是阴性对照有干扰，液相也提示四味药材均含有没食子酸，所以只用地榆药材做对照。该实验还调整了展开系统的比例为甲苯 （水饱和）-乙酸乙酯-甲酸（6∶2∶1），在此条件下，地榆的薄层点显色清晰，阴性对照无干扰。

丹参作为四味止血片中主要药味之一，其有效成分丹参素钠具有改善血液黏稠、扩张血管、改善微循环等药理作用，是治疗痛经、月经过多的常用有效成分之一。因此，该次质量标准修订增加了丹参中丹参素钠的含量测定项。该试验在考察了样品提取溶剂的用量、方法、时间等因素后确定了2．2．2项下供试品溶液的制备方法；选择流动相时，曾尝试不同比例的乙腈-2%冰醋酸溶液作为流动相，结果当乙腈与2%冰醋酸溶液的比例为5∶95时，样品峰保留时间合适，与杂质峰分离度良好，且峰型较好，阴性对照无干扰。

批号20170223与批号20170224样品中丹参素钠的含量远远低于批号20150317的含量，究其原因，可能由于原料的批次不一样导致。

参考文献

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．2015年版．北京：中国医药科技出版社，2005：290，126，76．

［2］王青虎，吴荣君，包宝乐尔，等．蒙药白益母草定性定量方法研究［J］．药物分析杂志，2015，35（10）：1846-1852．

［3］陈哲妮，黄婉锋．地榆炭配方颗粒的质量控制研究［J］．现代中药研究与实践，2012，26（2）：66-67．

［4］王雪彦，陈泽莲，宋毅．参苓胃炎合剂中丹参的薄层鉴别［J］．华西药学杂志，2013，28（6）：643-644．

［5］周振旗，王宁莉，王丽霞．丹参中丹参素钠的含量测定［J］．延安大学学报，2014，12（2）：49-51．

［6］吴海兰，孙宵琛，孟楣，等．HPLC测定八味芪丹胶囊中丹参素钠的含量［J］．中国中医药信息杂志，2015，22（1）：95-97．

［7］袁琦，赵辉．HPLC法测定复方丹参滴丸中丹参素的含量［J］．河南大学学报（医学版），2008，27（2）：31-33．