乳源金黄色葡萄球菌耐药性分析与分型

赵吴静，董书伟，倪春霞，武中庸，侯 晓，才让卓玛，蒲万霞

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，中国农业科学院新兽药工程重点开放实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；2.甘肃省兽药饲料监察所，兰州 730030）

乳房炎是奶牛养殖场中的高发病之一，该病易反复，对奶牛生长发育以及产品质量影响较大，甚至会使奶牛丧失生产性能而造成巨大损失［1］。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）可产生溶血毒素、肠毒素、血浆凝固酶、耐热核酸酶等毒素，引起急性、慢性和亚临床性（隐性乳房炎）乳房炎；也可引起化脓性感染、食物中毒、牛乳房炎、仔猪渗出性皮炎等疾病，其致病性强，危害性大，分离率不断上升［2-7］。近年来，由于抗生素的不合理使用，耐药金黄色葡萄球菌的感染率和分离率也不断增加。李光超等［8］采用微量肉汤稀释法测定其对7种药物的敏感性，结果显示，金黄色葡萄球菌对磷霉素最为敏感，而对红霉素、氨苄西林和克林霉素具有较强的耐药性。王华等［9］对兔源金黄色葡萄球菌进行了药敏性试验，结果显示，分离株对氨苄西林、青霉素高度敏感，对利福平、氟苯尼考、庆大霉素、氧氟沙星中度敏感，对头孢噻呋、环丙沙星、土霉素等耐药。王秋东等［10］采用微量肉汤稀释法对分离自内蒙古部分地区规模化奶牛场的14株金黄色葡萄球菌进行了药敏试验，结果表明，分离株对林可霉素、青霉素、环丙沙星、苯唑西林、红霉素、卡那霉素、四环素、头孢噻呋耐药，对万古霉素、泰妙菌素、沃尼妙林及氟苯尼考敏感。疫苗被认为是预防和治疗奶牛乳房炎最有效的手段，但疫苗研制的前提是必须清楚了解感染地区流行菌株的基因型特性［11］。DNA 随机多态性扩增（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是一种简便、快速、灵敏可行的遗传标记技术，目前该技术被普遍用于对微生物进行基因分型与鉴定［12-13］。笔者等对分离于上海和内蒙古地区的金黄色葡萄球菌进行药敏试验，确定其药物敏感性，以指导临床用药；同时采用RAPD技术对分离自我国内蒙古和上海两个地区的引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行基因分型，分析其分子流行病学特点，以期为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗的研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床样品及标准菌株

临床型乳房炎奶样采于内蒙古和上海地区的规模化奶牛养殖场；金黄色葡萄球菌标准株CVCC2246购自中国兽医药品监察所；表皮葡萄球菌作为阴性菌株，由中国农业科学院新兽药工程重点开放实验室分离鉴定。

1.2 试剂与仪器

DNA Ladder Marker、蛋白酶 K、溶菌酶、Premix EX Taq酶，均来自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；细菌染色体DNA提取试剂盒（离心柱型），来自TIANGEN生物制品公司；细菌DNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司生产；选用OXOID的氟哌酸、复方新诺明、左氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、青霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、万古霉素、四环素和先锋霉素V药敏纸片，直径为5mm；Applied Biosystems PCR扩增仪、DYY-8C型高压电泳仪、VITEK-2 COMPACT全自动微生物生化鉴定仪。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化 摇匀奶样，吸取200μL均匀涂布于血琼脂平板，37℃过夜培养。挑取大而凸起、表面光滑、湿润呈金黄或白色、周围有溶血圈的菌落进行纯化培养，涂片、革兰氏染色、镜检，对具有葡萄串状的分离菌进行进一步的生化鉴定、金黄色葡萄球菌16S rRNA PCR鉴定及特异性基因——耐热核酸酶基因nuc种属鉴定。1.3.2 生化鉴定 根据镜检结果，采用VITEK-2全自动微生物生化鉴定仪鉴定。

1.3.3 16S rRNA鉴定在无菌条件下，挑取纯培养单菌落于LB液体培养基中，37℃培养20～24 h。按天根基因组提取试剂盒的步骤提取细菌基因组DNA。利用细菌16S rRNA通用引物，并结合金黄色葡萄球菌特异性基因——耐热核酸酶基因nuc进行种属鉴定，引物序列信息见表1。

表1 鉴定金黄色葡萄球菌PCR引物

1.3.4 药敏试验 采用K-B纸片扩散法，选用“1.2”项中13种药敏片进行药敏试验，分别将菌株接种于5mL的MH液体培养基，37℃培养20～24 h，取200μL菌液均匀涂布在MH琼脂培养基上，置37℃培养20～24 h取出，用游标卡尺测量各菌抑菌圈直径，最后计算平均值，按照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）颁布的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》判断受试菌对药物的敏感性。

1.3.5 菌株RAPD分型 在无菌条件下，挑取纯培养单菌落于LB液体培养基中，37℃孵育20～24 h。按细菌DNA提取试剂盒操作。获得的DNA于-20℃保存备用。根据文献［14］选择序列 4M：5′-AAGACGCCGT-3′作为扩增引物。采用25μL反应体系，体系参数为：Premix混合液12.5μL，DNA模板2μL，引物2μL，去离子水8.5μL。PCR循环参数分别为94℃5min，37℃5min，72℃5min，循环 4次；94℃ 1min，37 ℃ 1min，72 ℃ 2min，循环 30次；72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，后用Quantity One 1-D成像系统紫外成像。电泳图像采用BioNumerics软件进行数据处理，具体参数设定标准如下：最适值为0.5%，位置公差为1.25%，阈值为80%。图像采用Dice相关系数和非加权组算术平均法UPGMA（Unweighted pair groupmethod with arithmeticmean）进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的生化鉴定及16S rRNA鉴定

2.1.1 菌株的生化鉴定 VITEK-2鉴定显示有91株被鉴定为金黄色葡萄球菌。

2.1.2 16S rRNA鉴定通过细菌16SrRNA通用引物，并结合金黄色葡萄球菌特异性基因——耐热核酸酶基因nuc进行种属鉴定。PCR扩增结果显示，扩增的16S rRNA基因片段及nuc基因片段与对照菌目的基因扩增长度相符。将预定基因进行测序并用NCBIBlast在线软件比对分析，有91株菌株被鉴定为金黄色葡萄球菌，与生化鉴定结果一致。

2.2 药敏试验结果

内蒙古地区临床型乳房炎金黄色葡萄球菌分离株对先锋霉素V、环丙沙星、氧氟沙星和左氟沙星均高度敏感，对万古霉素、庆大霉素、复方新诺明和青霉素均耐药；上海地区临床型乳房炎金黄色葡萄球菌分离株对左氟沙星和环丙沙星均高度敏感，对氯霉素、氧氟沙星、青霉素、红霉素、阿莫西林、庆大霉素、四环素和万古霉素均耐药。两个地区分离菌均对喹诺酮类抗生素高度敏感，说明此类抗生素对两个地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用（表2）。

表2 内蒙古和上海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌药敏试验结果mm

2.3 菌株RAPD分型

2.3.1 RAPD扩增结果 对分离鉴定出的91株金黄色葡萄球菌和1株金黄色葡萄球菌标准菌CVCC2246基因组DNA模板进行随机多态性扩增，由扩增产物凝胶电泳结果可知，除第76株外，所有菌株基因组DNA经扩增后均产生了清晰、可分辨的带谱，扩增产物在1～7条带之间，片段分子质量大小在400～4 500 bp之间，具有多种带型（图1）。

图1 92株金黄色葡萄球菌RAPD-PCR扩增条带

图2 92株金黄色葡萄球菌RAPD扩增产物的遗传聚类图

2.3.2 遗传相关性分析 聚类分析亲缘关系树状图（图2）显示，菌株共分为12个基因型，其中1型5株（5.5%），2型 6株 （6.6%），3型 15株 （16.5%），4型 10株（11.0%），5型 13株（14.3%），6型、9型和 12型各 2株（2.2%），7型8株（8.8%），8型24株（26.4%），10型 3株（3.3%），11型仅1株（1.1%）。8型菌株占总菌株数的26.4%，为主要流行的优势菌群。

3 讨论

奶牛乳房炎是奶牛养殖业最严重的隐患之一，也是影响奶牛业发展的主要疾病之一，因此，加强对奶牛乳房炎的诊断和防治尤为重要［15］。引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一是金黄色葡萄球菌，具有高传染性和难治愈等特性［16-17］。本研究对从内蒙古和上海地区分离鉴定的91株金黄色葡萄球菌进行药敏纸片试验，结果显示内蒙古地区和上海地区分离金黄色葡萄球菌均呈现多重耐药性，但耐药的抗生素种类有所不同，上海地区分离菌的耐药情况比内蒙古地区严重，这可能与地区用药种类、用药方法和剂量及菌株生长环境不同有关。

金黄色葡萄球菌易对抗生素产生多重耐药性［18-19］，使得其药物治愈率不佳，随着分子生物学的快速发展，从分子基因水平上研究金黄色葡萄球菌越来越受到人们重视［20］。由于各地区环境不同，养殖场饲养管理水平参差不齐，导致引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌差异较大，给疾病防治带来了诸多困难。为了解不同地区金黄色葡萄球菌的基因型特征，需对分离自奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行基因分型，尤其是对引发局部地区感染的致病性金黄色葡萄球菌进行基因分型，对实现奶牛乳房炎病原菌有效溯源和控制感染源具有重要意义。

RAPD是一种采用通用的随机引物对基因组DNA进行扩增，再利用扩增产物指纹图谱进行基因分型的技术。国内外学者均证实RAPD技术是一种应用比较广泛、灵敏、可行的分型方法。王琳等［21］对新疆地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行RAPD基因分型，16株菌可分为2个类群。Kurlenda等［22］对234株金黄色葡萄球菌进行RAPD分析，分为10个基因型。周长卿等［23］对青海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行RAPD基因型分析，可将21株金黄色葡萄球菌分为3个聚类群。于丹等［24］对北京地区奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行RAPD基因分型，通过聚类分析，29株菌产生11个基因型。

本试验采用随机引物4M对分离自我国不同地区的91株金黄色葡萄球菌和1株金黄色葡萄球菌标准菌基因组DNA模板进行随机多态性扩增，除第76株外，所有菌株基因组DNA经扩增后均产生了清晰、可分辨的带谱，可清晰反映菌株间的基因多态性特征。两个地区中，内蒙古地区主要集中于2、5型和8型，占其总菌数的61.8%。内蒙古地区菌株分布较广，但其余各基因型所占菌株数较少，可能为内蒙古地区养殖业发达，病原菌容易发生地区间流行传播。上海地区主要集中在3、4和8型，占其总菌数的64.3%。上海地区菌株分离于两不同奶牛场，其中某牛场菌株基因型较集中，另一牛场菌株基因型分布较广，这可能与牛场饲养管理水平等有关。

［1］ 王波.奶牛乳房炎的病因与防治［J］.畜牧兽医科技信息，2017（6）：73.

［2］ 赵吴静，徐进强，武中庸，等.苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌研究进展［J］.中国畜牧兽医，2017，44（8）：2458-2464.

［3］ 王明月，郭昌明，王方.吉林省某猪场新发猪葡萄球菌引起的化脓性肺炎［J］.中国兽医学报，2016（9）：1577-1581.

［4］ 杨岚，郝永清，何焱，等.金黄色葡萄球菌CP8-FnBPB-ClfA偶联蛋白对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫效果研究［J］.中国预防兽医学报，2015，37（3）：229-232.

［5］ 岑静，王赛，廖华媛，等.猪葡萄球菌的分离鉴定及其脱落素的研究［J］.中国兽医科学，2017（2）：212-216.

［6］ 高攀.新疆奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌耐药性、血清型调查和乳头灌注治疗实验［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2013.

［7］Botaro B G，Cortinhas C S，Dibbern A G，et al.Staph ylococus aureus intramammary infection afects milk yield and SCC of dairy cows［J］. Trop Anim Health Prod，2015，47（1）：61- 66.

［8］ 李光超，武小虎，马友记，等.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌耐药基因型和表型的相关性分析 ［J］.中国兽医科学，2016，46（8）：1057-1064.

［9］ 王华，周孝琼，吴小文，等.兔金黄色葡萄球菌病病原的分离鉴定及药敏试验［J］.中国兽医杂志，2013，49（8）：30-31.

［10］王秋东，刘琪，董志民，等.内蒙古部分地区致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和产色葡萄球菌的分子流行病学及耐药性研究［J］.中国预防兽医学报，2017（4）：257-261.

［11］高潮，刘国庆，赵莉莉，等.上海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌基因分型与耐药性研究［J］.上海交通大学学报，2014，32（1）：53-58.

［12］Elina R，Susana B，Cecilia F，et al.RAPD-PCR analysis of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine and human hosts［J］.Microbiol Res，2004，159：245-255.

［13］崔立云，张霄霄，杨毅梅.RAPD技术在寄生虫分类和鉴定中的应用［J］.中国人兽共患病学报，2012，28（4）：375-379.

［14］张善瑞，王长法，高运东，等.应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌［J］.家畜生态学报，2007，28（4）：78-80.

［15］Le Marechal C，Thiery R，Vautor E，et al.Mastitis impact on technological properties ofmilk and quality ofmilk products-a review［J］.Dairy Sci Technol,2011，91：247-282.

［16］ Talbot B G，Lacase P.Progress in the development of mastitis vaccines［J］.Livestock Production Sci，2005，98（1-2）：101-113.

［17］杨峰，王旭荣，田永刚，等.牛源金黄色葡萄球菌感染小鼠后诱导的氧化应激及其对药物的抗性变化［J］.动物医学进展，2013，34（12）：46-50.

［18］Ata NS，EL-Jakee，Nagwa S，et al.Antimicrobial resistance in clinical isolɑtes of Staphylococcus aureus from bovine and human sources in Egypt［J］.Glob Vet，2011，7（6）：581-586.

［19］Sabine P，Klaus O，Constanze W.Longitudinal study of the molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus at university hospital［J］.Journal of Clinical Microbiology，2006，44（12）：4297-4302.

［20］乌兰巴特尔，郝永清，海岩，等.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分子流行病学调查［J］.中国兽药杂志，2007，41（2）：21-23.

［21］王琳，杨学云，王治才，等.奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌RAPD-PCR 基因分型的研究［J］.中国畜牧兽医，2007，34（11）：76-78.

［22］Kurlenda J，Grinholc M，Jasek K，et al.Rapd typing of methicillin-resist ant Staphylococcus aureus：A 7-year experience in a Polish hospital［J］.Med SciMonit，2007，13（6）：13-18.

［23］周长卿，王珂，胡俊杰，等.青海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的基因型分析［J］.动物医学进展，2014，35（2）：11-16.

［24］于丹，毛双兰，韩博.奶牛乳样金黄色葡萄球菌的分离鉴定与RAPD分子分型研究［J］.畜牧与饲料科学，2015（Z1）：369-370.