绵羊A型魏氏梭菌感染血浆蛋白差异分析

郭虹

（平凉职业技术学院,甘肃 平凉 744000）

魏氏梭菌又称产气荚膜梭状芽饱杆菌（Clostridium welchii），是由英国人Welchii和Nutall在1892年首先从一具腐败的人类尸体产生气泡的血管中分离得到，并以Welchii命名为魏氏梭菌。魏氏梭菌广泛分布于自然界，常见于土壤、污水、饲料、食物和粪便，世界各地均有分布，也是肠道中常见菌之一，在一定条件下可引起严重疾病。目前发现的魏氏梭菌分为A，B，C，D和E五个型，菌体分泌的细菌毒素是引起人和动物发病的关键因素。羊和牛魏氏梭菌感染较为常见，而且一旦感染死亡率较高，主要发生于羊的毒血症，包括羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾等；该病病死率较高，动物一旦感染，死亡率可达70%～100%，给我国的养羊业造成了巨大的经济损失［1-3］。早期疫苗接种和快速准确诊断是预防和早期治疗的关键环节。随着人类血浆蛋白组学的提出，以血浆蛋白组变化筛选生物标记物为疾病早期诊断提供了强大的工具［4］。目前魏氏梭菌的诊断多以分子生物学诊断结合免疫学诊断为主，以蛋白组技术研究早期血浆蛋白变化寻找生物标记分子尚鲜见报道。本文利用2-DE和质谱技术研究早期感染魏氏梭菌绵羊血清蛋白变化，寻找有价值的蛋白质分子，为魏氏梭菌早期诊断提供依据，也为疾病的预防和新型疫苗研发提出了新思路。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

PROTEAN IEFCell等电聚焦系统、PROTEANⅡxi凝胶电泳系统、PDQUest 8.0图像分析软件系统、GS-800 Calibrated Densitometer凝胶扫描系统均为Bio-Rad公司产品；UV-1800紫外分光光度计为日本岛津公司产品；17 cm非线性固相化梯度胶条（pH值3～10）、17 cm非线性固相化梯度胶条（pH值3～10）、IPG Buffer pH值3～10、2-D cleanup kit、矿物油、丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺均为Bio-Rad公司产品；CHAPS、甘氨酸、二硫苏糖醇（DTT）和低熔点琼脂糖、Tris、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸胺、硫尿、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白、尿素均为Sigma公司产品；羊魏氏梭菌检测试剂盒；Album&IgG Depletion SpintrapTM为GE公司产品；其余药品均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 采样绵羊来自甘肃某羊场，现场临床诊断羊群精神沉郁，食欲废绝，腹泻，肌肉痉挛，倒地，四肢痉挛，角弓反张，有部分羊只死亡，而且发病到死亡病程较短，解剖病死羊只发现表面坏死；胸腔、腹腔、心脏等主要器官有大量积液；粘膜下组织常水肿；心内外膜有点状出血；肠道、肺的浆膜下可见出血，初步判定为魏氏梭菌感染，采集病情严重的绵羊血样，用羊魏氏梭菌检测试剂盒做进一步确证，收集阴性和阳性血清若干份，-20℃保存。

1.2.2 2-DE样品的制备 分别取检测出阴阳性血清样品，Bradford法定量，分装保存。

1.2.3 2 -DE电泳和SDS-PAGE电泳 取样品与350μL上样缓冲液（7M 尿素，2M 硫脲，65MmDTT，4%CHAPS，0.2%（w/v）Bio-Lyte，痕量溴酚蓝）混合，12 000×g，4℃离心5min。沿聚焦盘边缘从左到右线性加入样品，用镊子轻轻剥去解冻胶条的保护膜，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘，胶条上覆盖2～3mL矿物油。盖上盖子，设定等电聚焦程序。等电聚焦程序如下：50 V，12 h（主动水化）；250 V（线性），30min；1 000 V（快速），1 h；9 000 V（线性），5 h；9 000 V（快速），6 8000 Vh；250 V（快速），5 h；任意时间［5］。

配制胶条平衡缓冲液（50Mm Tris-HCl pH值8.8、6M尿素、20%甘油、2%SDS），等电聚焦结束，将聚焦好的胶条分别置于6mL平衡A液（含2%DTT的平衡缓冲液）和6mL平衡B液（含2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液）中水平摇床上各平衡15 min，然后转移胶条至12%的1mm SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳，待溴酚蓝距离板下沿1 cm左右停止电泳。

1.2.4 凝胶染色 40%的乙醇，10%的乙酸的固定液固定3 h以上；0.12%（w/v）的CBBG-250，10%的硫酸铵，10%的磷酸（v/v，85%的磷酸），20%的甲醇染色过夜；5%（m/v）硫酸铵，10%（v/v）甲醇脱色到背景清晰［6］。

1.2.5 图像采集与分析及差异点的切取 实验组和对照组均重复3次以上，2-DE凝胶背景消除，点的匹配用PDQUest8.0软件，数据统计用Excel2003。切胶笔切取差异蛋白点，去离子水冲洗干净，保存在50%乙氰溶液中。

1.2.6 蛋白质谱检测 胶粒用乙氰脱色，测序级胰蛋白酶37℃酶解过夜，取酶解上清。微量离子阱串联质谱仪LCQ Deca Xp plus系统处理样品，获得的原始数据整合在质谱仪上的Bioworks软件中的检索软件SEQUEST搜索 NCBInr（National center for biotechnology information）蛋白质数据库，选择的数据子库为羊。其次，检索结果输出后，采用 Single threshold（Xcorr分别为 1.9，2.2，3.75，相应电荷数为+1，+2，+3）参数对数据库结果进行筛选，去除角蛋白污染，并对鉴定蛋白质进行最终确定。根据鉴定蛋白质的FASTA格式序列文本，利用Compute p I/Mw Tool（http：//us.expasy.org/tools/pi_tool.html）计算每一个蛋白质的分子量和等电点。

2 结果与分析

2.1 Albumin&IgG Depletion SpintrapTM试剂盒去除高丰度蛋白效果分析

由图1可见，Albumin&IgG Depletion SpintrapTM试剂盒处理阴性和阳性血清样品，SDS-PAGE电泳分析IgG和Albumin去除效果，比较处理前后电泳条带发现，在150 kD左右及45 kD和66 kD之间局域处理后，样品蛋白染色明显变淡，高丰度蛋白去除效果良好。

注：1.蛋白质分子Marker；2.未处理的阴性血浆蛋白样品；3.处理后的阴性血浆蛋白样品；4.未处理的阳性血浆蛋白样品；5.处理后的阳性血浆蛋白样品。

2.2 健康绵羊与感染魏氏梭菌血浆蛋白2-DE图谱比较分析

由图2可知，2-DE凝胶经过染色、脱色处理，背景清晰的图片用PDQUest8.0软件分析，通过凝胶背景消除，蛋白点的统计及不同凝胶间蛋白点的匹配寻找到差异显著的蛋白点10个。其中蛋白点1、2、3在阳性血清中高表达，蛋白点 4、5、6、7、8、9 只在阳性血清中表达，蛋白点9只在阴性血清表达，蛋白点10在阴性血清中高表达。

图2 健康绵羊与感染魏氏梭菌绵羊血浆蛋白2-DE图谱比较分析

2.3 差异蛋白点的质谱结果

用干净的枪头切下差异蛋白点，乙腈脱色，测序级胰蛋白酶酶解，微量离子阱串联质谱仪LCQ Deca Xp plus系统处理样品，数据库搜索结果如表1所示。

表1 质谱鉴定的差异蛋白点

由表1可见，10个蛋白质点全部成功分析得到5种蛋白质，分别为转铁蛋白、结合珠蛋白、血浆淀粉样蛋白、免疫球蛋白和载脂蛋白，这些蛋白涉及机体脂肪代谢，应激反应以及免疫防御等功能。

3 讨论

魏氏梭菌在医学上是一类重要的梭菌，其病原体可引起人和动物的一些疾病，包括气性坏疽、食物中毒、婴儿坏死性小肠结肠炎以及胃肠坏疽，严重影响人和动物的食品卫生安全［7-8］。在绵羊上，A型魏氏梭菌引起黄羔病，是一种罕见的小羊肠毒血症，临床症状表现为抑郁、贫血、黄疸以及血红蛋白尿，尸检发现组织苍白，肝脏和脾脏变脆，膀胱中存有红尿。本研究取感染A型魏氏梭菌绵羊血清，Albumin&IgG Depletion SpintrapTM试剂盒去除血液中高丰度蛋白白蛋白和免疫球蛋白，传统的2-DE分离得到差异明显的蛋白点10个，质谱成功鉴定出5种蛋白质，蛋白点1、2、3和蛋白点4、5，以及蛋白点6、7、8分别只鉴定出同一种蛋白质，这是由于蛋白质翻译后修饰作用引起的。这些蛋白涉及机体脂肪代谢，应激反应以及免疫防御等功能。研究这些蛋白功能有助于深入了解魏氏梭菌感染机体的机理，为寻求新的疾病预防及治疗措施奠定基础。

［1］ 孟霞，孙翠平，唐娜，等.一株山羊魏氏梭菌的分离鉴定及其致病性研究［J］.中国畜牧兽医，2015，42（7）：1905-1909.

［2］ 余波，冉懋韬，谭诗文，等.羊魏氏梭菌PCR方法的建立及初步应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（11）：106-108.

［3］ 罗毅.奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定［J］.中国动物检疫，2011，28（8）：61-62.

［4］ Chan D T，Irish A B ，Dogra G K，etal.Dyslipidaemia and cardiorenal disease：mechanisms，therapeutic opportunities and clinical trials［J］.Atherosclerosis，2008，196：823-834.

［5］ 王建锋，赵兴绪，张勇，等.健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺核蛋白组差异表达分析［J］.畜牧兽医学报，2010，41（1）：105-111.

［6］ Jorg Reinders，Albert Sickmann.Proteomics［M］.New Jersey：Humana Press，2009.

［7］ MacLennan JD.The histotoxic clostridial infections of man［J］.Bacteriol Rev，1962，26：177-276.

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