冬凌草甲素逆转耐吉西他滨胰腺癌PANC-1/Gem细胞耐药性的研究

沈灿 胡正军 汪碧丽 张婷 许斌 许健

胰腺癌是一种常见的恶性消化道肿瘤，其预后差，病死率高，5年生存率仅5%，平均生存期＜6个月［1］。吉西他滨是胰腺癌化疗的一线临床药物，但由于毒副作用大，不良反应多及肿瘤细胞的耐药性使其疗效并不理想［2］。研究表明冬凌草甲素对白血病、宫颈癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞均有明显杀伤或抑制作用［3］。另外研究发现冬凌草甲素可通过多种信号通路促进肿瘤细胞凋亡蛋白的表达，影响细胞周期及调控miRNAs的表达等多种途径抑制肿瘤的生长，最终诱导细胞的凋亡和细胞的自噬［4］。2016年10月至2017年10月作者通过实验研究，探讨冬凌草甲素逆转胰腺癌细胞耐药性的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC-1由中国科学院上海细胞生物研究所提供。耐吉西他滨胰腺癌PANC-1/Gem细胞由本实验室经诱导耐药建立获得。盐酸吉西他滨由江苏豪森药厂股份有限公司提供，冬凌草甲素由格雷西亚化学技术有限公司提供。

1.2 动物 BALB/C（nu/nu）无胸腺裸鼠20只，由浙江中医药大学动物实验中心采购并提供无特殊病原体（SPF）饲养环境。

1.3 诱导建立人胰腺癌耐吉西他滨细胞株PANC-1/Gem 人胰腺癌细胞株PANC-1，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液和37℃、5%CO2的恒定培养箱中，当细胞汇合度达80%的致密单层后，改用含吉西他滨的培养基培养，经6个月的药物不断诱导建立人胰腺癌耐吉西他滨细胞株PANC-1/Gem。

1.4 CCK-8法检测药物对增殖活力的影响 PANC-1和PANC-1/Gem细胞传代培养于96孔板中。每组加入不同浓度的药物作用细胞，每组5个复孔。培养24h后，每孔中加入CCK-8溶液，2h后450nm波长处检测各孔吸光度值，并计算细胞对药物的半数抑制浓度（IC50）和耐药倍数。采用Chou-Talalay法计算药物相互作用的联合指数（CI）。

1.5 Western blot法检测相关蛋白表达 将PANC-1和PANC-1/Gem细胞接种于细胞培养皿中，不同药物组培养24h后裂解各组细胞提取蛋白，测定各组蛋白浓度，每孔按30μg的蛋白样品进行电泳。电泳结束后，转膜至PVDF膜。经封闭，一抗，二抗孵育后显色液显影，曝光。采集与分析蛋白条带灰度值，目的蛋白表达量以内参β-actin进行标准化，对比分析各实验组间蛋白表达的差异情况。

1.6 建立皮下异种移植瘤模型 取（2～3）×106的单细胞悬液接种于裸鼠右肩背部皮下，密切观察皮下肿瘤生长情况，待肉眼可见肿瘤时，随机将小鼠分为不同组别。吉西他滨组和联合组腹腔注射，1次/周，冬凌草甲素组腹腔注射，1次/d。

1.7 免疫组化法观察组织中相关耐药蛋白表达 剥取小鼠肿瘤组织及正常胰腺组织，经10%中性甲醛固定、组织脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片，免疫组织化学染色，标志物为MRP1，光学显微镜下观察组织染色情况，拍照。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素和吉西他滨对胰腺癌细胞增殖活力的影响 与空白组比较，冬凌草甲素和吉西他滨均能抑制胰腺癌细胞增殖，且呈浓度依赖性。PANC-1/Gem相比PANC-1细胞对吉西他滨的敏感性降低，耐药倍数=3.68（P＜0.01）。两株细胞对冬凌草甲素的半数抑制率浓度分别为60.23μmol/L，57.42μmol/L，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1、2。

2.2 冬凌草甲素和吉西他滨联合使用对PANC-1/Gem细胞增殖活力的影响 两药在不同浓度作用下的联合指数（CI）均为协同作用（CI＜1）。见表2、3。

表1 不同浓度吉西他滨对PANC-1/Gem和PANC-1细胞增殖的影响（x±s）

表2 不同浓度的吉西他滨对PANC-1/Gem和PANC-1细胞增殖的影响（x±s）

表3 不同浓度冬凌草甲素联合吉西他滨对PANC-1/Gem细胞的增殖抑制率（%）

表4 不同浓度冬凌草甲素联合吉西他滨对PANC-1/Gem细胞的联合指数

2.3 冬凌草甲素和吉西他滨对胰腺癌细胞耐药相关蛋白表达的影响 与PANC-1细胞比较，PANC-1/Gem中MRP1及GST-π蛋白的表达明显增高。冬凌草甲素和联合组作用后细胞中MRP1及GST-π蛋白明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。见图 1。

图1 冬凌草甲素和吉西他滨对胰腺癌细胞耐药相关蛋白表达的影响

2.4 冬凌草甲素和吉西他滨对PANC-1/Gem细胞体内生长的影响 与对照组肿瘤体积比较，吉西他滨组、冬凌草甲素组、联合组肿瘤体积均明显减小（P＜0.05，P＜0.01）。见图 2。

图2 冬凌草甲素和吉西他滨对PANC-1/Gem细胞体内生长的影响

2.5 冬凌草甲素和吉西他滨对移植瘤耐药相关蛋白表达的影响 与对照组和吉西他滨肿瘤组织比较，冬凌草甲素组和联合组中肿瘤组织中MRP1蛋白明显下降。见图3。

图3 冬凌草甲素和吉西他滨对PANC-1/Gem肿瘤组织中MRP1 蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，我国胰腺癌发病率呈快速上升趋势。由于起病隐匿，缺乏早期诊断指标，80%胰腺癌患者确诊时已是晚期或发生远处转移，失去手术指征。以吉西他滨为基础的化疗是目前临床上治疗晚期胰腺癌的主要手段，但中位生存时间及1年生存率方面并无突破［5］，其中肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性增高是化疗失败的主要原因之一。开展新的治疗药物和提高化疗药物的效果，对改善胰腺癌的预后有着重要意义。

本研究通过体外药物诱导建立耐吉西他滨胰腺癌细胞PANC-1/Gem。相比亲本细胞，PANC-1/Gem对吉西他滨的耐药性明显上升。冬凌草甲素作用两株胰腺癌细胞后能显著抑制细胞的增殖，结果与其他研究报道相符［6］。两株胰腺癌细胞对冬凌草甲素的敏感性无明显差异，提示冬凌草甲素能够逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。在冬凌草甲素联合吉西他滨作用耐吉西他滨胰腺癌PANC-1/Gem细胞研究中，联合用药较单药组比较明显抑制细胞的增殖，差异有统计学意义，且两药合用的联合指数（CI）＜1.0，表明冬凌草甲素和吉西他滨具有协同抑制胰腺癌细胞增殖的作用，结果与国内学者的研究相符［7］。

胰腺癌的耐药机制非常复杂，其中药物外排泵及药物解毒酶系统在胰腺癌耐药中发挥重要作用。ATP结合盒（ABC）是膜转运蛋白超家族一类ATP驱动泵，广泛分布各种生物体中，通过细胞膜或胞浆与细胞核之间药物摄入和外流改变使细胞内药物浓度，使进入到肿瘤细胞内的细胞毒药物排除到细胞外，从而使细胞内的药物浓度低于能够导致细胞死亡的阈浓度，对细胞起到保护作用［8］。其中P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）被证明在胰腺癌中呈高表达并在胰腺癌对化疗药物的耐药起到重要作用［9］。谷胱甘肽转移酶（GST）是谷胱甘肽参与反应的关键酶，可催化GSH与亲电子药物相结合，形成谷胱甘肽-S-共轭物复合物，从而增加药物的水溶性，加速排泄，使药物在细胞内的浓度降低。研究表明胰腺癌中GST表达较正常组织明显增高，通过抑制GST的表达可恢复化疗药物对胰腺癌的敏感性［10］。实验结果表明耐吉西他滨胰腺癌PANC-1/Gem较亲本细胞MRP1以及GST-π蛋白表达明显上升，吉西他滨作用后MRP1和GST-π蛋白进一步增高，表明MRP1和GST-π蛋白在胰腺癌对吉西他滨的耐药中起到了关键作用。冬凌草甲素及联合用药均可降低MRP1和GST-π蛋白的表达，证明冬凌草甲素能够逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。通过体内实验进一步验证冬凌草甲素能够协同吉西他滨抑制胰腺癌生长，同时降低相关耐药蛋白的表达，恢复胰腺癌对吉西他滨的敏感性。

综上所述，冬凌草甲素能够抑制胰腺癌细胞的增殖，通过降低MRP1及GST-π耐药蛋白的表达逆转PANC-1/Gem对吉西他滨的耐药性，增强吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤作用。冬凌草甲素逆转胰腺癌细胞耐药性的机制仍不完善，有待进一步的研究证明。

［1］ Wolfgang CL, Herman JM, Laheru DA, et al. Recent progress in pancreatic cancer. CA Cancer J Clin, 2013, 63(5): 318-348.

［2］ Sahoo RK, Kumar L. Albumin-bound paclitaxel plus gemcitabine in pancreatic cancer. N Engl J Med, 2014, 370(5): 478-479.

［3］ Guo Y, Shan Q, Gong Y, et al. Oridonin in combination with imatinib exerts synergetic anti-leukemia effect in Ph+ acute lymphoblastic leukemia cells in vitro by inhibiting activation of LYN/mTOR signaling pathway. Cancer Biol Ther, 2012, 13(13):1244-1254.

［4］ Chen RY, Xu B, Chen SF, et al. Effect of oridonin-mediated hallmark changes on inflammatory pathways in human pancreatic cancer(BxPC-3)cells. World J Gastroenterol, 2014, 20(40):14895-14903.

［5］ Hagmann W, Jesnoeski R, Lohr JM. Interdependence of gemcitabine treat ment, transporter expression, and resistance in human pancreatic carcinoma cells. Neoplasia, 2010, 12(9): 740-747.

［6］ 齐晓丽, 田克立, 张典瑞, 等. 冬凌草甲素诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡及对G_2/M细胞周期的阻滞作用. 山东大学学报(医学版), 2011, 2: 9-13.

［7］ 周黎明, 卜贺启, 刘殿雷, 等. 冬凌草甲素联合吉西他滨对胰腺癌SW1990 细胞抑制作用的研究. 天津医药, 2014, 09): 859-62.

［8］ Chen Z, Shi T, Zhang L, et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette(ABC)family in multidrug resistance:A review of the past decade. Cancer Lett, 2016, 370(1): 153-64.

［9］ O'Driscoll L, Wa lsh N, Larkin A, et al. MDR1/P-glycoprotein and MRP-1 drug efflux pumps in pancreatic carcinoma. Anticancer Res, 20 07, 27(4B): 2115-2120.

［10］ Schnelldorfer T, Gansauge S, Gansauge F, et al. Glutathione depletion causes cell growth inhibition and enhanced apoptosis in pancreatic cancer cells. Cancer, 2000, 89(7): 1440-1447.