大黄素对实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠的免疫保护作用研究

夏亚男 李宁⋆ 叶志鹏 黄捷 徐涛 吴可人

慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）又称自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病，是一种以自身甲状腺组织为靶器官损害的慢性炎症性自身免疫性疾病，约占甲状腺疾病的22.5%，其发病机制至今尚未清楚，目前认为是遗传和环境因素相互作用的结果［1］。近年来发病率有明显上升趋势，全世界发病率约0.15%～0.3%［2］。CLT治疗主要是纠正甲状腺功能异常和甲状腺肿大对症处理［3］。目前常用的药物治疗如甲状腺激素替代治疗、局部免疫调节治疗、硒治疗及中医药治疗等，均取得一定的临床疗效。大黄素属蒽醌类衍生物，是中药大黄的重要单体，有一定的免疫抑制作用。2016年6月至2017年6月作者通过实验研究，探讨大黄素对实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠的免疫保护作用与机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 6～8周龄NOD小鼠30只，雌雄不限，随机分为3 组，分别为对照组、模型组和大黄素组，每组各10只。

1.2 试剂与仪器 CD4、CD8、IFN-γ、IL-4抗体试剂盒；小鼠TgAb酶联免疫检测试剂盒；ELISA检测仪；流式细胞仪等。

1.3 动物模型建立 造模组小鼠饮用0.05%碘水（0.64g/L NaI）持续 8周，对照组小鼠饮用去离子水。造模4周后对大黄素组小鼠按大黄素75mg/（kg·d）灌胃处理，对照组和模型组小鼠分别以等量生理盐水灌胃，4周后处死小鼠，取外周血及甲状腺。

1.4 标本采集 小鼠乙醚麻醉后，取眶静脉血，室温静置6h，3000r/min离心20min，分离血清。于小鼠颈部正中切开并显露出两叶甲状腺组织，取下气管和甲状腺并迅速剥离甲状腺，冷生理盐水冲洗，滤纸吸干。

1.5 甲状腺病理学检查 小鼠甲状腺组织4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4μm切片，苏木素-伊红（HE）染色。采用图像分析计算炎症细胞（子目标面积）与甲状腺组织（目标面积）的比值，参考Tang H等［4］的炎症分级标准：0级：正常甲状腺组织；1级：淋巴细胞浸润程度＜1%；2级：淋巴细胞浸润程度占1%～10%；3级：淋巴细胞浸润程度占11%～40%；4级：淋巴细胞浸润程度＞40%。

1.6 血浆TgAb水平测定 采用 ELISA试剂盒双抗体夹心法测定：在各孔加入标准品或样品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗体工作液，37℃孵育60min；洗涤3次；加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次；加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl终止液，立即在450nm波长测量OD值并计算结果。

1.7 流式细胞术（FCM）测定外周血单核细胞（PBMC）中T细胞亚群频率 取三组小鼠外周血，分离PBMC细胞悬液。采用FCM检测分析三组小鼠PBMC中CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞的频率差异。使用50ng/ml佛波酯和1μg/ml离子霉素刺激两种细胞6h后，再应用FCM术检测分析三组小鼠PBMC中CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+T细胞频率差异。1.8 统计学方法 采用SPSS19.0软件统计。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型组小鼠在实验过程中死亡1只，其余各组小鼠均存活至实验结束。

2.1 甲状腺病理学检测及分级 显微镜下可见对照组甲状腺滤泡大小较为均匀一致，滤泡上皮细胞为单层立方形或高柱形。模型组滤泡结构紊乱，上皮细胞挤压变扁，间质减少，淋巴细胞浸润明显。大黄素组滤泡结构尚可，大小不一，少量淋巴细胞浸润（见图1）。根据炎症分级，大黄素组、模型组炎症程度均高于对照组，且大黄素组低于模型组，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）见表1。

图1 各组小鼠甲状腺组织炎症细胞浸润情况（HE染色 10×10

表1 甲状腺病理分级比较

2.2 血浆抗小鼠甲状腺球蛋白抗体（TgAb）水平检测 8周后检测各组小鼠血浆中TgAb浓度，大黄素组TgAb浓度低于模型组而高于对照组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组TgAb浓度较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 TgAb各组间比较［ng/L，（x±s）］

2.3 外周血单核细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的频率差异 造模后各组小鼠PBMC中CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞相对频率均比对照组明显增加，且大黄素组增加幅度低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。相比对照组，造模后各组小鼠PBMC中CD3+CD4+INF-γ+T细 胞、CD3+CD4+IL-4+T细胞相对频率均增加，且大黄素组增加幅度低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图2 各组PBMC中CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的差异比较

3 讨论

慢性淋巴细胞性甲状腺炎是临床最常见的自身免疫性甲状腺病，以甲状腺内炎症细胞浸润和TgAb等自身抗体的生成为主要特征，受遗传和环境等多种因素影响，其确切发病机制尚不明确［5］。本研究通过过量的碘剂诱导NOD小鼠建立EAT动物模型，造模小鼠甲状腺病理观察显示甲状腺滤泡结构紊乱，上皮细胞挤压变形，淋巴细胞浸润明显，同时血浆TgAb水平明显升高，表明过量碘剂诱导NOD小鼠建立EAT动物模型成功［6］。

CD4+和CD8+T细胞是人体免疫系统中的两种重要免疫细胞，CD4 主要表达于辅助T（Th）细胞，是Th细胞TCR识别抗原的共受体，与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导。而CD8主要表达于细胞毒性T细胞上，通过表面的MHCⅠ分子与CD4等其他免疫细胞的MHCⅡ分子结合，从而识别其他免疫细胞表面结合的抗原物质。研究发现，大黄素通过调节T淋巴细胞亚群之间的平衡、分化及其分泌能力而发挥免疫保护作用。郭向华等［7］研究发现芦荟大黄素能够调节CD4+/CD8+T 淋巴细胞亚群间的平衡，抑制Th1 型/Tc1 型细胞分化而发挥免疫抑制作用。沈乃营等［8］认为大黄素在体外可以通过调节活化淋巴细胞IL-4分泌的影响而发挥免疫抑制作用。本研究中，造模小鼠PBMC中CD4+和CD8+T细胞相对频率和血浆TgAb水平均较对照组增加，且大黄素组增加幅度明显低于模型组，大黄素的摄入减轻模型动物甲状腺组织淋巴细胞浸润程度，并降低血浆TgAb升高幅度，表明大黄素对EAT动物模型甲状腺组织有一定的免疫保护作用。

未致敏（naive）CD4+T细胞经抗原刺激后分化为Th0细胞，然后在不同细胞因子等诱导下功能性分化为Th1或Th2细胞而发挥作用。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，能通过直接调节靶细胞对凋亡的易感性，参与细胞凋亡信号的传导，促使甲状腺滤泡上皮细胞发生凋亡，导致甲状腺组织破坏［9］。IL-4主要由Th2细胞产生，其可诱导B淋巴细胞增殖、分化，促使其产生与体液免疫相关的特异性抗体，并使Th1 /Th2细胞因子的平衡改变，抑制Th1细胞因子介导的自身免疫反应。机体正常时，Th1和Th2细胞功能处于动态平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。当机体受到抗原刺激时，可导致Th1、Th2细胞及其分泌的细胞因子失衡，该现象又称Th1/Th2漂移。目前多数学者研究认为，Th1/Th2细胞因子的平衡偏移可以导致机体内免疫功能紊乱，可能是自身免疫性甲状腺疾病发生的一个关键机制［10-12］。本研究中，造模后小鼠PBMC细胞中CD3+CD4+INF-γ+ T细胞和CD3+CD4+IL-4+T细胞频率相比对照组均明显增加；大黄素干预的造模小鼠，Th1和Th2细胞因子阳性的T细胞频率均低于模型组，表明大黄素抑制Th细胞增殖分化及其细胞因子的分泌，减弱造模小鼠甲状腺组织的炎症反应。

综上，造模后小鼠PBMC中CD4+和CD8+T细胞、Th1和Th2细胞频率相比对照组均明显增加，且大黄素组各细胞频率低于模型组，表明大黄素通过抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞增殖分化，抑制Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的分泌，从而减轻造模小鼠甲状腺组织的炎症反应。

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