Septin2在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

李君君，方 磊，高 阳，时 帅，何昊宇，刘晓梅，袁彩君

锦州医科大学附属第一医院肿瘤内科 辽宁锦州 121000

胃癌是世界癌症死亡的第二大常见原因。Septin基因家族是一类具有GTPase活性的保守基因家族,参与细胞质分裂、细胞内物质转运、细胞周期调控及凋亡等重要生理过程[1-5]，与多种肿瘤的发生、转移关系密切[6-9]。Septin可保护原癌基因人类表皮生长因子受体2免于泛素化并胞吞和溶酶体降解，有助于癌细胞质膜上受体的稳定。有文献[10-11]报道Septin2在胃癌组织中的表达升高，并与胃癌的不良预后密切相关。本研究通过生物信息学方法分析胃癌组织和正常组织之间Septin2 mRNA的表达差异，通过免疫组化染色验证其在蛋白水平的表达差异，通过进一步的细胞实验明确Septin2表达变化对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨其成为监测胃癌发生的生物学标记物的可能性，为胃癌的治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1胃癌和正常组织中Septin2mRNA的表达差异和在线生存分析从基因表达综合数据库(GEO)中下载GSE54129数据集中的胃组织Septin2 mRNA表达谱，共132例，其中正常组织21例，癌组织111例；利用GEO2R分析工具分析对比胃癌组织和正常组织中Septin2 mRNA的表达差异。利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库中的胃癌数据进行在线生存分析；共631例，随访时间150个月，在随访期内死亡为终点事件；以Septin2 mRNA表达水平中位数为界分为低表达组和高表达组，分别绘制两组的生存曲线。

1.2胃癌组织中Septin2蛋白的检测采用免疫组化染色法。收集2016年锦州医科大学附属第一医院胃癌术后患者的病理蜡块共141例，其中胃正常组织23例，不典型增生组织2例，高、中、低分化腺癌组织7、50、57例，胃肠间质瘤组织2例。切片厚度4 μm，经脱苯脱蜡水化抗原修复等步骤后，将兔抗人Septin2抗体(稀释度1100)滴片，室温孵育2 h，PBS洗片后加入羊抗兔二抗(稀释度1500)室温孵育1 h，DAB显色，苏木精染核，透明封片。抗体购自美国Abcam公司。由病理科2位专家共同阅片。200倍显微镜下选择3个视野观察。按染色程度进行评分，未染色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，深黄色计3分；按染色区域百分比进行评分，0%～计0分，5%～计1分，25%～计2分，50%～计3分，75%～100%计4分；两项评分的乘积为最终评分。该实验获得锦州医科大学及其附属第一医院伦理委员会批准。

1.3转染Septin2对胃癌细胞生物学行为的影响

1.3.1 Septin2对胃癌细胞的转染 人胃癌细胞系SGC-7901和MNK-45购买于沈阳百思生物科技有限公司。将SGC-7901和MNK-45用含体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)于体积分数5% CO2、37 ℃条件下培养，并按常规方法传代、冻存和复苏。将SGC-7901和MNK-45接种到6孔板，待细胞汇合至70%～80%，使用Lipofectamine3000(美国赛默飞世尔科技公司)将Septin2表达质粒(锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室赠予)转染至细胞中，按说明书操作，37 ℃孵育细胞2 d， G418筛选，挑选单克隆细胞株2株进行传代培养。以未转染的细胞作为空白对照，以转染空质粒的细胞作为阴性对照。转染Septin2表达质粒的2株细胞分别为转染1组和转染2组。

1.3.2 细胞中Septin2 mRNA的检测 采用Real-time PCR法检测。收集细胞，提取细胞内总RNA，按反转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，再根据SYBR染料试剂盒说明进行荧光定量PCR检测，试剂盒及SYBR荧光染料均购自大连宝生物(TaKaRa)公司。Septin2上游引物序列：5’-AGCGCTCGAGCGCCACCATGTCTCGATTCTACGATG TCTAAGC-3’，下游：5’-AGCGAGAATTCTTACACGTG GTGCCCGAGAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CAAT GACCCCTTCATTGACC-3’，下游：5’-TGGAAGATGGT GATGGGATT-3’。PCR扩增体系：SYBR染料10 μL，模板cDNA 2 μL，DEPC水6 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各1 μL。扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火34 s，72 ℃延伸 34 s(59次循环)，65 ℃终延伸5 s，0.5 ℃结束。根据2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。实验重复3次。

1.3.3 细胞中Septin2 蛋白的检测 采用Western blot法检测。收集细胞，按蛋白提取试剂盒说明提取细胞内总蛋白并定量。以100 g/L SDS-PAGE凝胶在110 V下进行蛋白分离电泳，然后在60 V下将蛋白转印至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗(兔抗人Septin2抗体，稀释度1400；兔抗人GAPDH抗体，稀释度1500)4 ℃孵育过夜，次日加二抗(羊抗兔抗体，稀释度11 000)室温孵育1 h，ECL化学发光。实验重复3次。全蛋白提取试剂盒、超敏和化学发光试剂盒、兔抗人Septin2抗体购自Abcam公司，兔抗人GAPDH抗体购自沈阳万类生物公司。

1.3.4 细胞增殖能力的检测 MTT细胞增殖检测试剂盒购自沈阳万类生物公司。选用对数生长期的细胞，消化计数，接种于96孔板，2×103个/孔，用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基于体积分数5% CO2、37 ℃条件下培养，分别于细胞完全贴壁24、48、72 h后取出细胞，按MTT 细胞增殖检测试剂盒提示操作，最后于490 nm处检测培养孔光密度，表示细胞增殖能力。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.3.5 细胞凋亡的检测 凋亡检测试剂盒购自江苏凯基公司。收集细胞并用PBS冲洗2次，加入500 μL的1×Annexin V缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC标记的Annexin V试剂后，于37 ℃避光孵育15 min，然后每管加入5 μL PI标记的Annexin V试剂，1 h内上流式细胞仪检测，采用Flow Jo软件分析细胞凋亡率检测结果。实验重复3次。

1.4统计学处理应用SPSS 21.0对数据进行统计分析。胃癌组织和正常组织中Septin2 mRNA在线数据比较采用两独立样本t检验，生存曲线的比较采用log-rank检验，Septin2蛋白阳性表达率的比较采用χ2检验；4组胃癌细胞Septin2蛋白、mRNA相对表达量的比较，细胞增殖抑制率、凋亡率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1胃癌和正常组织中Septin2mRNA表达差异和在线生存分析结果GSE54129数据集中，胃正常组织和癌组织中Septin2 mRNA表达量分别为(6.42±0.25)、(8.70±0.43)，胃癌组织中Septin2 mRNA表达高于正常组织(t=23.511，P<0.001)。Septin2 mRNA高表达组和低表达组生存曲线见图1，两组比较，差异有统计学意义(P<0.001)，高表达组患者中位生存时间短于低表达组。

A:低表达组；B高表达组图1 Septin2 mRNA高表达组和低表达组的生存曲线

A～F:胃正常组织、不典型增生、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、胃肠间质瘤图2 不同胃组织中Septin2蛋白的表达(免疫组化染色，×200)

2.3转染Septin2的胃癌细胞中Septin2的表达SGC-7901和MNK-45转染Septin2表达质粒后，Septin2 mRNA和蛋白表达水平均升高，见图3、表1、表2。

1～4：SGC-7901细胞阴性对照组、空白对照组、转染1组、转染2组；5～8：MNK-45细胞阴性对照组、空白对照组、转染1组、转染2组图3 胃癌细胞Septin2蛋白的表达

表1 4组SGC-7901细胞中Septin2 mRNA和蛋白表达的比较

*：与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05。

表2 4组MNK-45细胞中Septin2 mRNA和蛋白表达的比较

*：与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05。

2.4转染Septin2的胃癌细胞增殖能力的变化SGC-7901和MNK-45细胞转染Septin2表达质粒后，细胞增殖能力增强，见表3、表4。

2.5转染Septin2的胃癌细胞凋亡能力的变化SGC-7901和MNK-45细胞转染Septin2表达质粒后，细胞凋亡受抑，见表5。

表3 4组SGC-7901细胞增殖能力的比较

*：与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05。

表4 4组MNK-45细胞增殖能力的比较

*：与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05。

表5 4组细胞凋亡率的比较 %

*：与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05。

3 讨论

Septin基因家族是一类具有GTPase活性的保守基因家族,目前已经发现至少13个家族成员,编码13个Septins (SEPT1～12, SEPT14)，家族成员之间具有很高的同源性，仅N端和C端稍有不同，位于其中央的GTP结合位点具有GTP酶活性，是最为保守的核心结构域[12]。研究[13]表明Septin蛋白是继微管蛋白、F-actin和中间纤维蛋白之后的第4种细胞骨架成分，并在细胞内物质运输、细胞分裂、细胞周期调控与凋亡等生理过程中发挥重要作用。Septin基因功能改变与霍奇金淋巴瘤、胆管细胞癌、乳腺癌、髓样白血病等肿瘤的发生密切相关[1,6-8]。Septin对脱落的肿瘤细胞细胞膜突起的形成至关重要，因此其可能在肿瘤细胞的转移行为中发挥重要作用[9]。作为Septin基因家族的重要癌症相关成员，Septin9已被证实与卵巢肿瘤、头颈部肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道的发生关系密切[9]。有临床试验[14-15]证实血浆中甲基化Septin9可作为结直肠癌机会性筛查的指标。Septin6在淋巴组织中广泛表达，且表达水平较高，其表达下调与婴幼儿急性髓系白血病发生有关，被认为是混合性系统白血病的一种融合伴侣[16]。

Septin2是一种GTP结合骨架蛋白，其基因位于2号染色体上，可通过与其他Septin蛋白形成核心复合体来发挥相应的功能。目前有关Septin2与肿瘤关系的研究较少。Septin2在脑肿瘤中的表达水平呈细胞周期依赖性，在G2/M期肿瘤细胞中表达水平最高；阻断星形胶质瘤细胞中Septin2的表达，细胞质分裂进程受阻，形成多核巨细胞[17]。有报道[18]抑制肝癌细胞中Septin2的表达，可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭，促进其凋亡。此外，有文献[19]报道乳腺癌细胞的侵袭和迁移活动需要通过Septin2基因激活MEK/ERK通路来实现。

目前，胃癌已是世界癌症死亡的第二大常见原因，将近60%的胃癌患者手术时已发生局部转移或远处转移。因此，明确胃癌发病机制以及寻求新的治疗靶点尤为重要。近年来，生物信息学技术的发展为发现癌症特征基因提供了新的思路。本研究利用生物信息学技术发现Septin2与胃癌的发生及预后有关；进一步的免疫组化和细胞实验明确了Septin2是与胃癌发生相关的癌基因，其表达上调可促进胃癌细胞的增殖，抑制其凋亡。Septin2有可能成为筛查、监测胃癌发生及判断预后的新的生物学标记物，也可能成为胃癌靶向治疗的新靶点，但其对胃癌细胞生物学行为的具体调控机制有待于进一步的探索。

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