两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立

（山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

近年来，随着人们生活水平的不断提高，各种美食丰富了人们的餐桌，潜伏的食品安全问题也随之出现。其中，最值得关注的问题就是肉掺假问题，市场上许多不法商家以未经检验的貂肉冒充羊肉、牛肉掺入肉卷等事件层出不穷[1]，对日常监管和检测能力都提出了新的挑战。当前，分子生物学是检测动物源性成分的重要手段[2]，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是通过热循环对目的基因进行扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分析，肉眼估算产物大小的一种检测方法，这种检测手段耗时较长，且溴化乙锭作为荧光染色剂具有一定的致癌性[3]，容易造成人为操作的误差和环境污染。因此，荧光PCR技术凭借其省时、特异性强、灵敏度高、无污染等特点，被质检部门广泛的运用到日常检验工作当中，成为打击不法商贩，进而维护消费者合法权益的强有力手段[4]。

在利用荧光PCR技术对样品进行检测时，通常需要选取含有目的基因的阳性物质作为试验对照，以确保试验结果的准确性，由于有些阳性材料难获取且有证标准物质具有价格昂贵、制作工艺复杂、有效期短等问题，影响了日常检验工作的开展[5]。为了解决阳性物质匮乏这一问题，众多检测机构都在研究用阳性质粒分子代替基体标准物质，用于动物源性成分的检测。2002年，日本科学家Kuribara等首次提出阳性质粒分子这一概念[6]，阳性质粒分子就是重组质粒分子，具有易构建、纯度高、繁殖快、成本低等优点，这种新型标准物质阳性质粒分子的出现，为动物源性成分的安全监管提供了阳性材料，缓解了由于标准物质缺乏造成的监管压力。

为了解决掺假问题对食品业的影响，商品化食品检测试剂盒作为一种新型快检方法被广泛应用到PCR分析当中，具有操作简便、方法可靠、成本可控等特点，适合现场的快速检测[7]。越来越多的机构投入到试剂盒的研发与生产中，也造成试剂盒质量良莠不齐的现象越来越明显，使得试剂盒的检验质量得不到保证。针对以上问题，本研究构建了水貂、紫貂两种成分的阳性质粒分子，并对其灵敏度和特异性进行了验证，同时对比了3家公司引物、探针对荧光PCR反应效率的影响，拟研究出一种经济、高效的实时荧光PCR反应体系，对于食品中动物源性成分准确可靠的鉴定具有重要意义和应用前景。

1 材料与方法

1.1 质粒的构建

根据设计的PCR引物，选择水貂线粒体细胞色素b基因、紫貂16s rRNA基因引物对基因组DNA进行扩增，得到扩增序列，链接pUC57载体，构建相应阳性质粒DNA分子，序列合成由济南博尚生物技术有限公司完成。

1.2 主要试剂

Premix Ex Taq HS 酶（0.05 U/μL）：Trkara公司；水貂、紫貂的引物和探针（见表1）分别由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）、济南博尚生物技术有限公司（Biosune）、宝日医生物技术（北京）有限公司（Trkara）三家公司合成。

表1 实时荧光PCR检测引物、探针Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-PCR

1.3 主要仪器

QuantStudio7 Flex实时荧光PCR仪：美国ABI公司；NanoDrop 2000c生物紫外可见分光光度计：美国Thermo公司；5424R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；UV3 HEPA PCR反应工作台：美国思博明科学器材公司。

1.4 实时荧光PCR检测

实时荧光PCR反应体系：Premix Ex Taq HS酶12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探针（5μmol/L）1 μL，样品 DNA（10 μg/mL～100 μg/mL）2.0 μL，加蒸馏水补足至25μL。实时荧光PCR反应参数为：95℃/10 s，1个循环；95℃/5 s，52℃/10 s，72℃/34 s，40个循环。试验结果用QuantStudio7Flex实时荧光PCR仪进行分析，根据SN/T 3730.1-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法》[8]对结果的表述，当Ct值≤35时判定扩增结果为阳性。

2 结果与分析

2.1 阳性质粒分子检测体系的验证

2.1.1 特异性检测

按照1.4的PCR反应体系，分别以水貂、紫貂阳性质粒分子为模板进行荧光PCR扩增，同时以水貂、紫貂提取的DNA作为阳性对照，以猪肉提取的DNA作为阴性对照，以灭菌水作为空白对照，对所构建的水貂、紫貂阳性质粒分子的PCR反应体系进行特异性验证。检测结果表明，两种质粒分子和阳性对照均在40个循环内出现显著扩增，阴性对照没有信号，表明构建的两种质粒具有良好的特异性，可以代替基因组作为阳性对照来使用（图1）。

图1 阳性质粒分子实时荧光PCR特异性检测结果Fig.1 Real-time fluoresce quantitative specificity curve of positive plasmid molecule

2.1.2 灵敏度验证

将水貂、紫貂阳性质粒分子进行10倍浓度梯度稀释，从 100 ng/μL 稀释至 10-5ng/μL，用梯度稀释后的质粒做模板进行荧光PCR扩增，分别对灵敏度进行验证，结果见图2。

图2 阳性质粒分子实时荧光PCR特异性检测结果Fig.2 Real-time fluoresce quantitative sensitivity curve of positive plasmid molecule

通常认为，当Ct值≤35时，可判定被检样品为阳性，以能够检出样品的最低浓度作为相应的检出下限，由此可见，水貂、紫貂质粒分子的灵敏度检出下限分别为10-4、10-3ng/μL，均具有较高的检测灵敏度。

2.1.3 标准曲线的绘制

以X轴代表质粒拷贝数的对数，Y轴代表Ct值，绘制标准曲线（见图3）[9]。

图3 阳性质粒分子实时荧光PCR标准曲线Fig.3 Real-time fluoresce quantitative standard curve of positive plasmid molecule

根据图3标准曲线可知，当质粒浓度从100 ng/μL～10-2ng/μL时，随质粒稀释度的增加，对应的Ct值也逐渐增大，且具有一定的梯度关系。两个标准曲线的扩增效率分别为103.211%、98.834%，且相关系数R2均大于0.99，说明在模板浓度范围内都具有很好的线性关系，可以用于样品的定量分析。

2.2 不同公司引物探针对实时荧光PCR反应的影响

将水貂、紫貂阳性质粒分子进行10倍梯度稀释，从 100 ng/μL 稀释至 10-5ng/μL，选取 Sangon、Biosune、Trkara三家公司合成的引物、探针对各浓度模板分别进行实时荧光PCR反应，对其反应效果进行比较分析，结果见图4～图5。

检测结果表明，使用3家公司合成的引物、探针对各浓度模板进行扩增时均可得到标准的S型扩增曲线，所有扩增曲线拐点清楚，指数增长期明显，基线平稳无上扬[10]，且扩增曲线的重复性比较好，基线起峰范围适当，Ct值随模板浓度下降而下降[11]，不同的引物、探针所得到的检出限略有不同。

如图4 所示，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探针分别进行实时荧光PCR反应，水貂阳性质粒的灵敏度检出限分别为 10-4、10-4、10-3ng/μL。显然，Sangon与Biosune合成引物、探针的灵敏度检出限与Trkara相比要高一个浓度梯度，且重复性和反应效率都略优于Trkara公司的DNA聚合酶。

由图5 可知，利用 Sangon、Biosune、Trkara合成的引物、探针分别进行实时荧光PCR反应，紫貂阳性质粒的灵敏度检出限分别为 10-3、10-2、10-1ng/μL。可见，Sangon公司合成引物、探针的灵敏度最高，且反应效率高于其他两家公司。

图4 3家公司引物、探针实时荧光PCR反应效果比较（水貂）Fig.4 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（mink）

图5 3家公司引物、探针实时荧光PCR反应效果比较（紫貂）Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies（Martes zibellina）

3 结论

引物、探针的正确选择是PCR反应成功的前提，高质量的引物、探针对PCR扩增效率具有很大的影响[12]。完成水貂、紫貂两种阳性质粒分子的构建，发现这两种质粒分子均具有灵敏度高、特异性强等特点，同时对PCR反应的关键技术指标-引物、探针进行验证，发现Sangon公司合成的引物、探针的灵敏度略优于Biosune与TaKaRa公司。为进行荧光PCR反应时引物、探针的选择提供一定的技术依据，为广大食品企业及有关监管部门监测评价和控制动物制品的品质提供新的思路和有效手段，对于食品中动物源性成分日常鉴定和风险评估具有重要的应用价值。

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