温度和多胺对柑橘溃疡病发生的影响及作用机制

杨枫，陈传武，范七君，石春梅，谢宗周，郭大勇，刘继红



温度和多胺对柑橘溃疡病发生的影响及作用机制

杨枫1，陈传武2，范七君2，石春梅1，谢宗周1，郭大勇1，刘继红1

（1华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；2广西特色作物研究院/广西柑橘生物学重点实验室，广西桂林 541004）

【目的】溃疡病是严重危害柑橘的一种细菌性病害，通常在高温下容易发生。论文旨在阐明高温下柑橘易发生溃疡病的机制，揭示其代谢变化，为利用药剂防治溃疡病提供重要的理论指导。【方法】以感病的甜橙（）为研究对象，在21℃和30℃下预培养3 d，然后均接种同样浓度（108cfu/ml）的柑橘溃疡病菌（subsp.，）10 μl，比较两组植株的发病率，采用半定量RT-PCR分析两种温度下4个抗病基因、、和的表达量，利用HPLC测定预培养3 d后叶片内源多胺（腐胺、亚精胺和精胺）的含量。在此基础上，利用外源亚精胺（0.4 mmol·L-1）处理甜橙植株（以清水处理为对照），比较亚精胺和清水处理的植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数，分析亚精胺处理对内源多胺含量和抗病基因、、和表达的影响。【结果】溃疡病菌接种后观察发现，21℃培养植株溃疡病的发病率在前期低于30℃培养的植株，至第10天时，两个处理组植株的发病率接近；同时HPLC测定发现，21℃培养植株叶片3种自由态多胺（腐胺、亚精胺和精胺）含量高于30℃培养植株；RT-PCR分析表明，、和这3个抗病基因的表达量在21℃培养植株中高于30℃培养植株，而表达水平在两组材料中差异不明显。外源亚精胺处理显著增加了内源腐胺和亚精胺的含量，降低了所处理植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数,接种后14 d发病率比对照降低45%，病情指数比对照降低4.8，而由表型可见对照发病程度重于亚精胺处理材料。此外，亚精胺处理能够增强、、和4个抗病基因的表达量。【结论】高温下甜橙更易发生溃疡病的可能机制是高温抑制抗病基因的表达和多胺合成。外源多胺处理能够降低甜橙发生溃疡病，可能机制是多胺处理后增强了抗病基因的表达，诱发植株的抗病反应最终表现出抗病。因此，高温是影响溃疡病发生的一个关键环境因子，多胺有助于提高对柑橘溃疡病的抗性。

柑橘；溃疡病；高温；多胺；抗病基因；抗病性

0 引言

【研究意义】细菌性溃疡病（bacterial canker disease，BCD）是严重危害柑橘的一种病害，在世界范围内对柑橘产业造成了大的损失，被列入检疫性病害，其病原为柑橘黄单胞菌柑橘亚种（subsp.，）[1]。可侵染柑橘叶片、皮刺、枝条及果实，造成落叶、梢枯、削弱树势等危害，严重时还引起落果。由于细菌性溃疡病对于柑橘树体正常生长和果实产量及品质均有重要的影响，培育抗溃疡病的柑橘品种或采取有效的防病措施对于柑橘产业持续、健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，从寄主角度针对柑橘溃疡病开展的工作主要包括以下几个方面：分析不同柑橘品种或资源对的抗性差异[2]、克隆和鉴定抗病基因[3-5]、解析柑橘对应答的生理或分子机制[6]、柑橘遗传转化和转基因植株抗性评价[7-9]、外源药剂（如水杨酸）防控强溃疡病等[10]，对揭示柑橘抗病性差异的生理和分子机制、发掘和创制抗性资源等起到了重要的作用。柑橘基因型是影响溃疡病发生程度的一个重要因素，大多数柑橘栽培品种均易发生溃疡病，而金柑和枸橼C-05（）则较少发病，后者更是被认为对柑橘溃疡病具有免疫抗性[2,6]。对抗病和感病的柑橘资源进行分析，发现叶片结构、气孔大小与密度、叶片分泌物质、抗氧化酶活性及基因表达谱等与溃疡病抗性强弱有关[2,6,10]。如有报道表明气孔小可能是金柑抗病的一个的结构机制，能够限制进入叶片的细菌数量[6]；枸橼C-05叶片分泌特殊的物质抑制溃疡病菌生长，使其表现出较好的抗性[2]。植物在遭受病原入侵时，会主动合成一些物质去增强抗病性。研究表明，在抗病中起作用的次生代谢物较多，多胺是其中一种。多胺是广泛存在于活体生物中的一类低分子量含氮脂肪碱，具有多聚阳离子特性，在生理pH下带正电荷，能够共价结合带负电荷的大分子物质（如DNA、RNA、染色质和蛋白质等），因而参与了许多植物生理和生物学过程[11-12]。高等植物中常见的多胺为腐胺（putrescine，Put）、亚精胺（spermidine，Spd）和精胺（spermine，Spm）。此外，多胺还被认为具有清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）、调节渗透压的作用[11]。基于多胺这些特性，大量研究认为，多胺是植物应答非生物胁迫的一类重要代谢物[12]。研究还表明，多胺在植物应答生物胁迫中也发挥着重要的作用[13-14]，这主要是基于以下研究结果：（1）植物在病原菌入侵时，多胺合成酶活性上升，使体内积累多胺[15]。如大麦在接种白粉病菌（）后，鸟胺酸脱羧酶活性显著增加，叶片中自由态Spd、共轭态Spd和Put含量升高[16]。对烟草接种活体营养型细菌后发现，植株体内Spm显著增加[17]。这些结果说明多胺参与寄主植物的病原应答过程；（2）外源施用多胺能增强植物的抗病能力，如外源添加Spm增强了烟草对烟草花叶病毒（，TMV）的抗性[18]；（3）超表达多胺合成基因，使转基因植株中的多胺含量增加，其抗病性也得以增强[9]。【本研究切入点】无论是开展抗病育种还是研发溃疡病防控技术，理论上均需要对柑橘应答的侵染进行深入地研究。柑橘溃疡病在高温环境下容易发生，但这一现象的机制却知之甚少。此外，利用外源多胺防控溃疡病发生的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以冰糖橙（）为供试材料，比较不同温度下植株接种溃疡病菌后的发病情况、多胺含量及抗病基因的表达，同时分析外源多胺处理能否增强抗病能力。阐明高温下柑橘易发溃疡病的可能机制，同时为研发和应用基于外源物质处理增强抗病性的技术提供理论指导。

1 材料与方法

试验于2014年在华中农业大学园艺林学学院和广西特色作物研究院完成。

1.1 植物材料和菌株

植物材料为三年生冰糖橙植株，接种用的柑橘溃疡病菌株由华中农业大学植物病理实验室洪霓教授提供。病菌在SPA培养基（蔗糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 7.2—7.4）中悬浮培养，接种试验在广西特色作物研究院进行。

1.2 处理

选取叶龄为30—45 d、部位相同且长势良好的夏稍枝条，田间取回后迅速将枝条下端插入清水中，分为两组，分别放置于21℃和30℃光照培养箱中，72 h后用于接种，在温度处理结束后取叶片用于多胺含量测定和抗病基因表达分析。此外，为研究多胺是否有利于增强溃疡病抗性，将冰糖橙植株分别用清水或0.4 mmol·L-1亚精胺（Spd）溶液每24 h喷施叶面一次，连续处理72 h。Spd处理结束后取叶片测定内源多胺含量（所取叶片先经清水洗净擦干），同时将处理的叶片接种。为分析抗病基因表达，将Spd喷施叶片3 d和7 d，取处理前和处理后的叶片用于抗病基因表达分析。

1.3 Xcc接种

参考Wang等[6]针刺接种法，将需要接种的叶片用清水洗净擦干，在叶脉两侧相同部位用接种针各刺5个伤口，在每个伤口周围分别再刺5个小伤口。随后用移液枪吸取配置好的菌液10 μl（浓度约为108cfu/ml）打在伤口上。将接种后的叶片套上塑料袋，放置于28℃条件下培养，在接种后不同时间（温度处理材料在接种后第3、7、10天；多胺处理材料在接种后第7、10、14天）统计发病率与病情指数。每个处理组各统计50个病斑，分析软件为ImageJ（NIH）。

1.4 多胺提取与测定

参考Zhang等[19]方法，将叶片在液氮中研磨成粉末，取0.1 g加入1 ml浓度为5%的高氯酸（perchloric acid，PCA），涡旋混匀后冰上放置30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，将上清液转入一个新的离心管。沉淀中加入1 ml PCA，重复前面的步骤，离心后将两次上清液合并（即为多胺粗提液）。取1 ml粗提液至10 ml离心管，加入50ml己二胺（1 mmol·L-1），加入1 ml的2 mol·L-1NaOH，涡旋混匀；加入10ml苯甲酰氯，涡旋20 s，37℃水浴20 min；加入2 ml饱和NaCl和2 ml乙醚，混匀后于8 000 r/min离心5 min；取1 ml乙醚相，真空浓缩干燥25 min；加200—500ml色谱级甲醇（Fisher，美国）溶解，0.22 μm有机滤膜过滤后取20ml在安装紫外检测器高效液相色谱系统（HPLC，Agilent 1200）中上样。多胺检测波长为230 nm，采用安捷伦C18反向色谱柱（4.6 mm×150 mm，孔径5 μm）。洗脱液为色谱级甲醇∕水（A相/B相），采用梯度洗脱，流速0.7 ml·min-1，柱温25℃。梯度洗脱程序见表1[20]。

1.5 RNA提取及RT-PCR

利用RNAiso Plus RNA试剂盒（TaKaRa公司）提取总RNA，总RNA使用DnaseI（TaKaRa）在37℃下去除DNA污染，然后采用ReverTra Ace-a-TM试剂盒（Toyobo，Japan）合成cDNA。使用Nanodrop 1000紫外分光光度计（Thermo Scientific）测定cDNA浓度，稀释到200 ng·μl-1后用于RT-PCR。RT-PCR反应体系（25 μl）包括5×缓冲液2.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1each）0.5 μL，MgCl2（1.5 mmol·L-1）1.5 μL，聚合酶1 μL，正向和反向引物各1 μL（终浓度为0.25 μmol·L-1，引物见表2），cDNA模板1 μL，加去离子水至25 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共28个循环，72℃保温10 min。用于表达分析的抗病相关基因有（chitinase）、（allene oxide synthase）、（glutathione peroxidase）和（pathogenesis-related protein 4A），以作为内参基因。

表1 自由态多胺分离所用HPLC洗脱程序

1.6 数据统计与分析

每个处理设置3个重复，数据采用Excel 2010作图，通过Excel自带软件ANOVA（Analysis of Variance）进行差异显著性分析（＜0.05）。

表2 本研究中RT-PCR分析所用引物序列

2 结果

2.1 不同温度培养植株叶片发病情况

冰糖橙植株在21℃和30℃培养3 d后用于溃疡病菌接种，在接种后第3、7和10天观察两个处理组植株的发病率。两个处理组植株叶片在第3天均出现病斑，但二者的发病率却存在差异。21℃条件下培养植株叶片在第3天的发病率为10%，而30℃条件下培养植株叶片的发病率接近40%。在第7天时两组材料的发病率均有所增加，但30℃条件下培养植株的发病率更高。然而，在第10天时，两个处理组植株的发病率接近（图1）。

2.2 不同温度处理后叶片多胺含量和抗病基因表达比较

多胺与植物的抗病能力有关[13-14]，因此，分析了21℃和30℃下培养3 d的冰糖橙植株自由态多胺含量。由图2-A可见，两组处理材料中均能成功地检测到常见的3种自由态多胺，即腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）。但21℃条件下预培养植株叶片自由态Put、Spd和Spm含量均高于30℃下培养植株，表明高温条件下植株多胺合成减少。

图1 21℃和30℃条件下预培养3 d的植株接种Xcc后的发病率

植物抗病性差异很大程度上与抗病基因表达有关[21-22]，因此，对21℃和30℃培养植株4个抗病基因、、和的表达进行分析。由图2-B可以看出，除表达水平在两组材料中差异不明显外，其余3个基因的表达水平在30℃培养植株中均要低于21℃培养植株，表明高温可能抑制了抗病基因的表达。

2.3 外源亚精胺处理后植株内源多胺含量及抗病基因表达变化

由图2中可以看出，冰糖橙中Spd含量高于Put和Spm。因此，对冰糖橙植株外源施用Spd，以分析是否有利于增强抗病性。外源Spd处理3 d后，采集叶片分析游离态多胺含量（图3-A）。可以看出，与对照（清水）处理相比，Spd处理材料中Put和Spd含量均明显增加，但Spm含量差异不大。

Spd处理3 d后，、、和4个抗病基因的表达上调，其中和诱导最为强烈；在处理7 d后和表达水平达到最大值，而和的表达水平维持稳定（图3-B）。

*表示两种温度下含量差异显著（P＜0.05） * indicates siginificantly different of content between the two temperautres (P＜0.05)

图3 外源亚精胺和清水处理后叶片自由态多胺含量（A）和抗病基因表达量（B）

2.4 外源亚精胺处理对溃疡病抗性的影响

将清水或Spd处理叶片针刺接种，接种后观察发病情况。由表型可见，接种后第7天时两个处理组的叶片可以看到白色病斑，但Spd处理材料出现病斑的伤口明显比对照组少或小；在第14天时对照发病程度重于Spd处理材料（图4-A）。通过发病率比较也可以看出，在接种后14 d时Spd处理材料的发病率约为40%，而对照组在接种后14 d时的发病率为85%（图4-B）。Spd处理组14 d时病情指数为4.2，但清水对照组在接种后第14天病情指数为9.0（图4-C）。结果表明，外源Spd处理能够增强冰糖橙叶片对柑橘溃疡病的抗性。

图4 外源Spd处理对溃疡病抗性的影响

3 讨论

植物对病原入侵的应答受多个因素影响，其中一个重要因素是温度[23]。通常认为，适合生长的最佳温度范围为20—30℃，在此范围里温度增加则会加重溃疡病发生[24]。本研究发现，在较高温度下培养一段时间的植株对更敏感，表明高温能促进寄主的发病或降低其抗病性，研究结果在一定程度上解释了柑橘在高温季节更容易感染溃疡病的原因；另一方面也暗示，在高温季节做好柑橘溃疡病防治可能对于控制该病的发生和蔓延具有关键作用。

当病原入侵时，植物会启动非病原特异性抗病反应，这是一种先天免疫特征，在感病或抗病植株、合适或不合适生长条件下均存在[25]。此过程中，植物在生理、代谢、细胞和分子水平上发生一系列的改变，包括代谢物的积累和基因表达的变化[21,26]。本研究发现，30℃条件下植株体内积累的多胺含量低于21℃条件下生长的植株；此外，还发现3个抗病基因表达水平在高温下受到抑制。高温下生长的植株易感染溃疡病可能与其体内积累的代谢物（如本研究中的多胺）减少或抗病基因（如、和等）表达受抑制有关。高温下多胺含量减少可能由于合成受阻所致，前期有研究表明，多胺合成关键基因（精氨酸脱羧酶）在高温下表达下调，而多胺含量一定程度上取决于其合成基因在转录水平上的表达[11,27]。因此，高温下多胺合成可能受到抑制，从而减少体内多胺含量。高温下、和表达受抑制的原因尚不清楚，一个可能的机制是高温抑制了调控上述3个抗病基因的转录激活因子或激活了某些转录抑制因子，使抗病基因的表达受到抑制，这一推论是否正确需要进一步证实。

本研究中，高温下植株多胺含量减少，其溃疡病抗性降低；相反，外源Spd处理提高了内源Spd含量，并增强了所处理植株的溃疡病抗性，表明柑橘植株积累较高水平的多胺有利于提高其溃疡病抗性。事实上，前期已有研究发现，超表达多胺合成基因提高了甜橙转基因植株内源多胺含量，显著增强了转基因植株对溃疡病的抗性[8]。多胺在抗病中的作用机制可能体现在如下两个方面：（1）多胺作为信号分子参与抗病信号的传递[28-29]，但这一机制是否在溃疡病抗性中发挥作用尚待证实；（2）多胺降解产生H2O2诱发抗病反应。研究表明，多胺合成后被转运到质外体，进而由多胺氧化酶分解产生H2O2[30-31]，而H2O2是调节气孔运动和引起过敏性反应（HR）的重要信号分子[32]。气孔是溃疡病菌进入植株体内的主要通道，当H2O2产生后能够促进气孔关闭，阻止溃疡病菌通过气孔进入体内[7]；此外，H2O2可以促进HR引起的细胞死亡从而将病原菌局限在接种部位。已有较多研究表明多胺分解形成的H2O2在植物防御病原入侵方面发挥着重要的作用[14,16,32-36]。因此，多胺更可能是通过产生H2O2来促进气孔关闭或触发局部HR来增强溃疡病抗性。

病原入侵会产生相应的胁迫信号，植物感知和传递该信号并启动相应的防御网络，最终通过改变大量抗病基因的表达水平来应答病原入侵，暗示抗病基因的表达变化是植物-病原互作过程中一个极为重要的防御反应[22,26,37]。研究表明，PR蛋白是植物防御病原侵染最为重要的一类基因，通常被用作植物抗病反应的标记基因。CHI与PR4A分别是PR3和PR4类PR蛋白，在植物系统获得性抗性中发挥着重要作用[38]。GPX参与细胞生化反应的多个过程，在保护寄主植物被病原入侵中也发挥关键作用[39]，AOS是茉莉酸合成的一种重要酶，而茉莉酸在植物防御反应中具有重要作用[40]。本研究中，发现两种温度下培养的植株虽然表达水平变化不大，但30℃下生长的植株、和表达水平明显低于21℃下生长的植株。此外，外源Spd增强了溃疡病抗性，与之一致的是4个基因的表达水平得以升高。可以清楚地看出，上述基因的表达水平与溃疡病抗性呈正相关，表明它们在柑橘抗病反应中可能有重要的作用，是今后开展分子育种增强溃疡病抗性的重要候选基因。

4 结论

高温下甜橙更容易受柑橘溃疡病菌危害，其可能的机制是高温抑制抗病基因的表达和降低多胺的合成。外源多胺处理能够增强甜橙溃疡病抗性，可能原因是多胺处理后增强了抗病基因的表达，从而诱发植株的抗病反应最终表现出抗病。高温是影响溃疡病发生的一个关键环境因素，多胺有助于提高对柑橘溃疡病的抗性。

[1] Das A K. Citrus canker-A review., 2003, 5(1): 52-60.

[2] 葛红娟, 龙桂友, 戴素明, 李大志, 李娜, 邓子牛. 冰糖橙与枸橼C-05对溃疡病菌生长特性的影响. 中国农业科学, 2015, 48(7): 1383-1391.

GE H J, LONG G Y, DAI S M, LI D Z, LI N, DENG Z N. The influence of ‘Bingtang’ sweet orange or citron C-05 on the growth characteristics ofpv.., 2015, 48(7): 1383-1391. (in Chinese)

[3] 周鹏飞, 贾瑞瑞, 陈善春, 许兰珍, 彭爱红, 雷天刚, 李强, 陈敏, 白晓晶, 邹修平, 何永睿. 柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析. 园艺学报, 2017, 44(3): 452-462.

ZHOU P F, JIA R R, CHEN S C, XU L Z, PENG A H, LEI T G, LI Q, CHEN M, BAI X J, ZOU X P, HE Y R. Cloning and expression analysis of four citrus WRKY genes responding topv.., 2017, 44(3): 452-462. (in Chinese)

[4] 贾瑞瑞,周鹏飞, 白晓晶, 陈善春, 许兰珍, 彭爱红, 雷天刚, 姚利晓, 陈敏, 何永睿, 李强. 柑橘响应溃疡病菌转录因子CsBZIP40的克隆及功能分析. 中国农业科学, 2017, 50(13): 2488-2497.

JIA R R, ZHOU P F, BAI X J, CHEN S C, XU L Z, PENG A H, LEI T G, YAO L X, CHEN M, HE Y R, LI Q. Gene cloning and expression analysis of canker-related transcription factor CsBZIP40 in citrus., 2017, 50(13): 2488-2497. (in Chinese)

[5] Zhang J L, Huguet-Tapia J C, Hu Y, Jones J, Wang N, Liu S Z, White F F. Homologues of CsLOB1 in citrus function as disease susceptibility genes in citrus canker., 2017, 18(6): 798-810.

[6] Wang Y, Fu X Z, Liu J H, Hong N. Differential structure and physiological response to canker challenge between ‘Meiwa’ kumquat and ‘Newhall’ navel orange with contrasting resistance., 2011, 128(2): 115-123.

[7] Jia H G, Zhang Y Z, Orbovic V, Xu J, White F F, Jones J B, Wang N. Genome editing of the disease susceptibility gene, 2017, 15(7): 817-823.

[8] Fu X Z, Chen C W, Wang Y, Liu J H, Moriguchi T. Ectopic expression of MdSPDS1 in sweet orange (Osbeck) reduces canker susceptibility: involvement of H2O2production and transcriptional alteration., 2011, 11: 55.

[9] Shimada T, Endo T, Rodriguez A, Fujii H, Goto S, Matsuura T, Hojo Y, Ikeda Y, Mori I C, Fujikawa T, Pena L, Omura M. Ectopic accumulation of linalool confers resistance tosubsp.in transgenic sweet orange plants., 2017, 37(5): 654-664.

[10] Wang Y, Liu J H. Exogenous treatment with salicylic acid attenuates occurrence of citrus canker in susceptible navel orange (Osbeck)., 2012, 169(12): 1143-1149.

[11] Liu J H, Wang W, Wu H, Gong X Q, Moriguchi T. Polyamines function in stress tolerance: from synthesis to regulation., 2015, 6: 827.

[12] Liu J H, Kitashiba H, Wang J, Ban Y, Moriguchi T. Polyamines and their ability to provide environmental stress tolerance to plants., 2007, 24(1): 117-126.

[13] Walters D R. Polyamines and plant disease., 2003, 64(1): 97-107.

[14] Walters D R. Resistance to plant pathogens: possible roles for free polyamines and polyamine catabolism., 2003, 159(1): 109-115.

[15] Marini F, Betti L, Scaramagli S, Biondi S, Torrigiani P. Polyamine metabolism is upregulated in response to tobacco mosaic virus in hypersensitive, but not in susceptible, tobacco., 2001, 149(2): 301-309.

[16] Cowley T, Walters D R. Polyamine metabolism in barley reacting hypersensitively to the powdery mildew fungusf. sp.., 2002, 25: 461-468.

[17] Marina M, Maiale S J, Rossi F R, Romero M F, Rivas E I, Garriz A, Ruiz O A, Pieckenstain F L. Apoplastic polyamine oxidation plays different roles in local responses of tobacco to infection by the necrotrophic fungusand the biotrophic bacterium., 2008, 147(4): 2164-2178.

[18] Yamakawa H, Kamada H, Satoh M, Ohashi Y. Spermine is a salicylate-independent endogenous inducer for both tobacco acidic pathogenesis-related proteins and resistance against tobacco mosaic virus infection., 1998, 118(4): 1213-1222.

[19] Zhang Q H, Wang M, Hu J B, Wang W, Fu X Z, Liu J H.offunctions in dehydration tolerance by reducing stomatal density and maintaining reactive oxygen species homeostasis., 2015, 66(19): 5911-5927.

[20] Wang W, Liu J H.offunctions in polyamine terminal catabolism and inhibits plant growth under salt stress., 2016, 6: 31384.

[21] Bruce T J, Pickett J A. Plant defence signalling induced by biotic attacks., 2007, 10(4): 387-392.

[22] Du M, Zhao J, Tzeng D T W, Liu Y Y, Deng L, Yang T, Zhai Q, Wu F, Huang Z, Zhou M, Wang Q, Chen Q, Zhong S, Li C B, Li C. MYC2 orchestrates a hierarchical transcriptional cascade that regulates jasmonate-mediated plant immunity in tomato., 2017, 29(8): 1883-1906.

[23] Hua J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature., 2013, 16(4): 406-413.

[24] 傅志华, 徐展华, 许渭根. 柑橘溃疡病田间消长规律及药剂防治技术. 植保技术与推广, 2000, 20(6): 34-35.

FU Z H, XU Z H, XU W G. Dynamic regulation in field and the chemical control techniques of citrus canker., 2000, 20(6): 34-35. (in Chinese)

[25] Hadwiger L A, Tanaka K. Non-host resistance: DNA damage is associated with SA signaling for induction of PR genes and contributes to the growth suppression of a pea pathogen on pea endocarp tissue., 2017, 8: Article 446.

[26] Singh K B, Foley R C, Oñate-Sánchez L. Transcription factors in plant defense and stress responses., 2002, 5(5): 430-436.

[27] Liu J H, Ban Y, Wen X P, Nakajima I, Moriguchi T. Molecular cloning and expression analysis of an arginine decarboxylase gene from peach ()., 2009, 429(1/2): 10-17.

[28] Kasukabe Y, He L X, Nada K, Misawa S, Ihara I, Tachibana S. Overexpression of spermidine synthase enhances tolerance to multiple environmental stresses and up-regulates the expression of various stress regulated genes in transgenic., 2004, 45(6): 712-722.

[29] Mitsuya Y, Takahashi Y, Berberich T, Miyazaki A, Matsumura H, Takahashi H, Terauchi R, Kusano T. Spermine signaling plays a significant role in the defense response ofto cucumber mosaic virus., 2009, 166(6): 626-643.

[30] Moschou P N, Paschalidis K A, Roubelakis-Angelakis K A. Plant polyamine catabolism., 2008, 3(12): 1061-1066.

[31] Moschou P N, Sanmartin M, Andriopoulou A H, Rojo E, Sanchez-Serrano J J, Roubelakis-Angelakis K A. Bridging the gap between plant and mammalian polyamine catabolism: a novel peroxisomal polyamine oxidase responsible for a full back-conversion pathway in., 2008, 147(4): 1845-1857.

[32] Yoda H, Hiroi Y, Sano H. Polyamine oxidase is one of the key elements for oxidative burst to induce programmed cell death in tobacco cultured cells., 2006, 142(1): 193-206.

[33] Cowley T, Walters D R. Polyamine metabolism in an incompatible interaction between barley and the powdery mildew fungus,f. sp.., 2002, 150(11/12): 581-586.

[34] Rea G, Metoui O, Infantino A, Federico R, Angelini R. Copper amine oxidase expression in defense responses to wounding andinvasion., 2002, 128(3): 865-875.

[35] Yoda H, Yamaguchi Y, Sano H. Induction of hypersensitive cell death by hydrogen peroxide produced through polyamine degradation in tobacco plants., 2003, 132(4): 1973-1981.

[36] Yoda H, Fujimura K, Takahashi H, Munemura I, Uchimiya H, Sano H. Polyamines as a common source of hydrogen peroxide in host- and nonhost hypersensitive response during pathogen infection., 2009, 70(1/2): 103-112.

[37] Gururani M A, Venkatesh J, Upadhyaya C P, Nookaraju A, Pandey S K, Park S W. Plant disease resistance genes: Current status and future directions., 2002, 78: 51-65.

[38] Jwa N S, Agrawal G K, Tamogami S, Yonekura M, Han O, Iwahashi H, Rakwal R. Role of defense/stress-related marker genes, proteins and secondary metabolites in defining rice self-defense mechanisms., 2006, 44(5/6): 261-273.

[39] Mullineaux P M, Rausch T. Glutathione, photosynthesis and the redox regulation of stress-responsive gene expression., 2005, 86(3): 459-474.

[40] Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S, Han K S, Agrawal V P. Molecular cloning and mRNA expression analysis of the first rice jasmonate biosynthetic pathway gene allene oxide synthase., 2002, 40(9): 771-782.

（责任编辑 岳梅）

Influence of Temperature and Polyamines on Occurrence of Citrus Canker Disease and Underlying Mechanisms

YANG Feng1, CHEN ChuanWu2, FAN QiJun2, SHI ChunMei1, XIE ZongZhou1, GUO DaYong1, LIU JiHong1

(1College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Wuhan 430070;2Guangxi Academy of Specialty Crops/Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology, Guilin 541004, Guangxi)

【Objective】 Canker disease is one of the most devastating diseases that cause serious damages to citrus. It is more likely to occur under high temperature. The objective of this study is to elucidate the mechanism underlying the disease incidence at high temperatures, reveal its metabolic changes, and to provide important theoretical guidance for controlling the disease using certain chemicals.【Method】 Sweet orange (), which is sensitive to canker disease, was used as the experimental material. The sweet orange plants were pre-cultured for 3 d at either 21℃ or 30℃ prior to inoculation withsubsp.(), followed by evaluation of disease incidence. Expression of four defense-related genes, including(allene oxide synthase),(chitinase),(glutathione peroxidase) and(pathogenesis-related protein 4A), in the plants pre-cultured at the two temperatures was assessed by semi-quantitative RT-PCR. Meanwhile, endogenous polyamines (putrescine, spermidine and spermine) in the plants pre-cultured at the two temperatures were also analyzed by HPLC. In addition, sweet orange plants were treated with exogenous spermidine (0.4 mmol·L-1), using water treatment as a control, beforeinoculation. Disease incidence and index of plants treated with either spermidine or water were compared, while endogenous polyamine contents and expression levels of defense-related genes (,,and) in response to spermidine or water treatment were assessed. 【Result】 After inoculation with, it was found that plants pre-cultured at 21℃ exhibited a lower cankder disease incidence at the early stage when compared with the plants pre-cultured at 30℃. On the 10th day, the incidence of the two treatments was similar. HPLC analysis showed that content of the three free polyamines (putrescine, spermidine and spermine) in plants pre-cultured at 21℃was significantly higher than that in the plants pre-cultured at 30℃. In addition, RT-PCR analysis indicated that the transcript level of three defense-related genes,,and, in plants kept at 21℃ was higher than that from 30℃, while there was no significant difference inexpression between the two groups. Exogenous application of spermidine remarkably enhanced levels of endogenous putresicne and spermidine, reduced disease incidence and index in comparison with water treatment. Spermidine treatment reduced the disease incidence by 45% and in comparison with the control after 14 days of inoculation. In addition, the disease index of the spermidine-treated samples was 4.8 lower than that of the control.Meanwhile, the phenotype indicated that the control displayed more serious symptom than that of spermidine treatment. Moreover, spermidine treatment could up-regualte mRNA abundances of all four defense-realted genes, including,,and.【Conclusion】Sweet orange displayed susceptibility to citrus canker at high temperature, and the potential mechanisms underlying this phenomenon may be ascribed to inhibition of defense-related genes and suppression of polyamine biosynthesis. Exogenous polyamine treatment conferred enhanced tolerance to citrus canker by upregulating defense-related genes and triggering disease resistance response. Taken together, high temperature is one of the environmental factors accounting for outbreak of citrus canker disease, and polyamines are conducive for improving tolerance to citrus canker disease.

citrus; canker disease; high temperature; polyamines; defense-related genes; disease resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.009

2017-10-16；

2017-12-06

国家公益性行业（农业）科研专项（201003067）、万人计划创新领军人才、湖北省自然科学基金创新群体（2017CFA018）、广西柑橘生物学重点实验室培育基地开放课题（桂柑科201202k003，桂柑科201201z004）

杨枫，E-mail：124272531@qq.com。陈传武，E-mail：jk_ccw@126.com。杨枫和陈传武为同等贡献作者。通信作者刘继红，Tel：027-87282399；E-mail：liujihong@mail.hzau.edu.cn