基于萘酰腙类锌离子增强型荧光探针的合成及光谱性能

吴红梅， 郭 宇*， 曹建芳， 吴中立

(1. 辽宁工业大学 化学与环境工程学院, 辽宁 锦州 121001； 2. 辽宁工业大学 机械工程与自动化学院， 辽宁 锦州 121001)

1 引 言

锌离子(Zn2+)是生命体系内含量位居第二的金属离子，在激素分泌、神经传导、细胞分裂和生长、基因表达、酶活性、核酸和蛋白质的合成等生命过程中发挥着重要的作用[1-4]，因此Zn2+代谢失常会影响人体的生长发育和多种疾病的发生[5-6]，如癫痫症、脑缺血、白内障、夜盲症、老年痴呆症等。另外，伴随着金属锌在机械制造、合金制造、电池电极和电镀防腐等领域广泛应用，大量的锌以Zn2+形式进入环境，成为污染离子[7-8]。因此，快速、高效预警Zn2+的研究对医学、化学、生物学、农学和环境学领域具有重要的研究意义。

目前，对金属离子的检测方法有原子吸收光谱法、质谱法、比色法、电化学法、色谱法和荧光探针法等[9-12]，其中荧光探针法由于高灵敏度、高选择性、简便快捷、开-关可调和原位检测等优点，广泛应用于分子和离子的检测。近年来，报道了许多Zn2+荧光探针，如喹啉类、苯并咪唑类、罗丹明类、蒽类等[13-17]。然而，尽管有些Zn2+荧光探针性能优良，但合成步骤复杂、水溶性较差、具有一定的毒性，限制了它的实际应用。

2 实 验

2.1 主要试剂与仪器

试剂：丹磺酰氯、2-羟基-1-萘醛、对氨基苯甲酸、氯化亚砜、三乙胺、水合肼、冰醋酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醚、丙酮、无水硫酸钠、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、去离子水。

仪器：HPLC-Q-Tof MS 型质谱仪、Varian INOVA-400MHz核磁共振仪、Elementar varioEL Ⅲ元素分析仪、HP8453紫外-可见光谱仪、JASCO FP-6500荧光光谱仪、HPLC-Q-Tof MS 型质谱仪。

2.2 Zn2+荧光探针HM的合成

锌离子荧光探针HM的合成路线见图1。以对氨基苯甲酸为原料依次进行酯化、酰化、肼解，最后与2-羟基-1-萘醛进行席夫碱反应得到。中间产物A1、A2和A3的合成方法见前期工作[21]。

图1 荧光探针HM的合成示意图

Zn2+荧光探针HM的合成：在甲醇溶液中，将中间产物A3与2-羟基-1-萘醛在冰醋酸催化下反应24 h，冷却、除去溶剂后得到的产品为黄色粉末，产率为82%。产品的ESI-MS质谱如图2所示。从图中可以观察到2个主峰，分别为m/z=537.2归属于 (HM-H)-，m/z=573.0归属于(HM+Cl)-；元素分析计算值：C，66.90%；H，4.87%；N，10.40%；实验值：C，66.92%；H，4.86%；N，10.36%。1H NMR谱(d6-DMSO)如图3所示，从指认结果得出谱图信息与探针HM的结构相符。

图2 荧光探针HM的ESI-MS谱图

图3 荧光探针HM的1H NMR谱图(d6-DMSO)

2.3 光谱测试

2.3.1 配制溶液

将荧光探针HM配制成1.0×10-3mol/L的DMF溶液，金属离子配制成2.0×10-2mol/L的水溶液，用于光谱测试的溶液根据需求由上述高浓度溶液稀释得到，探针HM的稀释溶剂为DMF/H2O(9∶1，v/v)的混合溶剂、金属离子的稀释溶剂为水溶液。

2.3.2 光谱测试

紫外光谱测试：移取2 mL探针HM溶液(20 μmol/L)加入到比色皿中，然后向其中加入特定浓度Zn(NO3)2水溶液，直至平衡，测定300～500 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。

荧光光谱测试：移取2 mL探针HM溶液(50 μmol/L)加入到比色皿中，用Zn(NO3)2水溶液滴定，直至平衡，用波长396 nm的光激发，测定400～750 nm范围内的荧光光谱。

3 结果与讨论

3.1 HM-Zn2+的电喷雾质谱分析

图4 HM-Zn2+的ESI-MS质谱

将上述2个峰值用Isopro3.0 program软件进行模拟，可以看出实验结果与理论值相吻合，说明荧光探针HM与Zn2+以1∶1的模式配位，并且形成的配合物HM-Zn能够在溶液中稳定存在。

3.2 紫外光谱

图5 向探针HM(20 μmol/L)中加入Zn2+的紫外滴定曲线

图5为向探针HM(20 μmol/L)的DMF/H2O(9∶1,v/v)溶液中加入Zn(NO3)2后的紫外滴定光谱图。从图中可以看出，探针HM在386 nm处出现2-羟基-1-萘醛的特征吸收峰，当加入Zn2+后386 nm处的吸收峰逐渐减弱，这主要是由于2-羟基-1-萘醛产生π-π*跃迁的结果。而且由于探针HM与Zn2+结合后形成新的配合物，产生的由金属锌到HM的电荷跃迁，在420 nm处出现了新的吸收峰，并且强度逐渐增大，直至达到平衡，等吸收点为396 nm。

为进一步验证HM与Zn2+的配位比例做了Job’s plot实验，保持HM和Zn2+总浓度为20 μmol/L，在420 nm处测定不同[HM]/[Zn2+]比值的吸收强度，如图6所示。从图中可以看出[HM]/[HM+Zn2+]值为0.5时吸收强度最大，说明HM与Zn2+的配位比例为1∶1，与电喷雾质谱数据结果一致(图4)。利用紫外吸收峰396 nm处吸光度值进行Benesi-Hildebrand数据拟合，计算平衡常数，如图7所示，具体过程如下：

(1)

其中，A0是探针HM的吸光度值，A是在探针HM中加入一定量的Zn2+后的吸光度值，Al是在探针HM中加入过量Zn2+的吸光度值，n为加入Zn2+的倍数，K为平衡常数。线性拟合的相关度R为0.998，平衡常数K=4.05×106L·mol-1。

图6 探针HM与Zn2+配位的Job’s plot 曲线

图7 探针HM与Zn2+配位的平衡常数线性拟合曲线

3.3 荧光光谱分析

探针HM对Zn2+识别的荧光滴定曲线如图8所示，以396 nm为激发波长，发现荧光探针HM (50 μmol/L) 在发射峰为510 nm处有弱荧光，当向探针HM中引入Zn2+后在波长510 nm 处荧光强度逐渐增大，并且强度增大2.5倍，荧光量子产率为0.02(参比物为Ru(2,2-bpy)2(ClO4)2)。探针HM对Zn2+的识别过程主要是由于PET(光诱导电子转移机理)和CHEF(螯合荧光增强机理)共同作用的结果，当荧光探针HM的识别基团2-羟基-1-萘醛上的O、酰基O和席夫碱的N原子与Zn2+配位后不仅增大了荧光探针HM自身的平面刚性，同时导致识别基团供电子能力下降，进而抑制了识别基团2-羟基-1-萘醛向荧光基团丹磺酰胺的光诱导电子转移，被激发的电子直接跃迁返回基态，从而在510 nm处荧光强度显著增大。

图8 向探针HM中加入Zn2+的荧光滴定曲线，λex=396 nm。

借助量子化学软件gaussian09，采用DFT方法，B3LYP泛函，6-31G(d,p)基组，研究了Zn2+荧光探针HM的发光机制，结果如图9所示。在没有加入Zn2+之前，配位基团部分的HOMO 能级(-5.606 eV)恰好介于丹磺酰胺的HOMO能级(-5.608 eV)和LUMO(-1.559 eV)能级之间，使分子产生PET，荧光强度很弱；加入Zn2+后，配位基团部分的HOMO能级(-6.538 eV)降低，PET过程受阻，使丹磺酰胺LUMO能级的电子顺利回到HOMO能级产生荧光，实现了对Zn2+的识别。

在10 μmol/L探针HM的溶液中逐渐加入Zn2+，在最优化条件下，检测Zn2+的线性区间在0～20 μmol/L区间，如图10所示，线性回归方程为y=193.8530+67.5749x，线性相关系数为R=0.998，最低检测限达到1.0×10-5mol/L。

图9 Zn2+荧光探针HM的PET过程

图10 Zn2+加入量与发射峰强度的线性拟合图

3.4 选择性测试

荧光探针对金属离子的识别，其选择性尤为重要。图11为荧光探针HM对Zn2+选择性测试结果。从图中可以看出，在发射波长510 nm处探针HM仅对Zn2+具有特殊响应，而加入Li+、 Na+、K+、Ca2+、Cr3+、Mn2+、Ag+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+和Cu2+等金属离子时荧光强度并没有增大，表明探针HM对Zn2+具有良好的选择性。原因可归结为在空间上探针HM对Zn2+具有合适的配位构型，并且对Zn2+螯合的平衡常数较大，在激发波长为396 nm时HM-Zn配合物具有较强的荧光发射，从而实现对Zn2+的高选择性识别。

图11 探针HM对Zn2+的选择性测试, λex=396 nm。

Fig.11 Fluorescence responses of HM upon addition of different metal ions(Li+， Na+， K+， Zn2+， Ca2+， Cr3+， Mn2+， Ag+， Co2+， Hg2+， Ni2+， Pb2+， Cu2+) in an aqueous solution of DMF/H2O(9∶1,v/v),λex=396 nm.

3.5 pH依赖测试

图12 探针HM对Zn2+的识别的pH依赖测试

4 结 论

本文设计合成了一种新型酰腙类单三齿Zn2+荧光探针HM，该探针合成方法简单、 产率较高，能够与Zn2+形成1∶1的稳定配合物，平衡常数为4.05×106L·mol-1；在众多金属离子中，HM仅与Zn2+结合后在发射波长510 nm处荧光强度增强2.5倍。探针HM能够高选择性、高灵敏度地识别Zn2+，最低检测限达1.0×10-5mol/L。

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