植物油中甾醇含量快速测定方法

邹燕娣 包李林 熊巍林 周青燕 林俞霞

(道道全粮油股份有限公司;国家油菜籽加工技术研发分中心，岳阳 414000)

植物甾醇是一种三萜醇类化合物，其化学结构与胆固醇非常相似，仅侧链结构不同，是一种天然的活性成分，具有十分重要的生理功能，如降胆固醇浓度、抗癌作用、基体抗氧化、预防心脑血管、免疫调节等特点[1-5]，广泛应用在医药和化妆品行业。植物甾醇广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子中[6]，在所有来源于植物种子的油脂中都含有甾醇，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等，具有开发利用价值。植物油是人类膳食甾醇的主要来源，其提供的植物甾醇占膳食总摄入量40%。因此测定植物油中甾醇含量很有意义。目前植物油中甾醇含量的测定方法主要有薄层色谱法(TLC)[7]、气相色谱法(GC)[8-10]和高效液相色谱法(HPLC)[11-13]等，其中气相分析色谱法分离效果好、分析速度快、灵敏度高、操作简便。本文借鉴GB/T 25223—2010《动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法》[14]进行植物油中甾醇含量测定，并对其进行改进，使得检测方法更简单，检测线更低，结果更准确。

1 材料与方法

1.1 仪器

7890B型安捷伦气相色谱仪，HP-5色谱柱；检测器：FID；HH-8数显恒温水浴锅；玻璃层析柱：长47 cm，内径1.0 cm；R201D旋转蒸发仪：附真空泵和水浴锅；10 cm×10 cm普通硅胶薄层板；碘单质；玻璃展开槽：合适10 cm×20 cm薄层板的使用；展开剂∶V(正己烷)∶V(乙醚)=50∶50。

1.2 试剂

甾醇标准品(胆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇)：纯度≥95%；胆固醇：纯度≥99%；豆甾醇标准品：纯度≥95%；正庚烷：色谱纯；乙醇：分析纯；乙醚：色谱纯(重蒸)；氧化铝：分析纯(60～200目，层析专用)；Ⅰ级氧化铝：氧化铝置于450 ℃下煅烧12 h，室温下黑暗静止12 h；1.2 mol/L KOH-乙醇溶液；33.6 g KOH溶于100 mL超纯水中，用乙醇定容至500 mL；1.0 mg/mL胆固醇内标溶液：准确称取0.1 g(精确至0.000 1 g)胆固醇于100 mL容量瓶中，加入正庚烷溶解并定容。豆甾醇标准溶液Ⅰ：称取豆甾醇标准品0.021 4 g(精确至0.000 1 g)于烧瓶中，精确量取10 mL胆固醇内标溶液，加热回流15 min，冷却至常温。0.471 8 mg/mL豆甾醇标准溶液Ⅱ:准确称取一定量的豆甾醇(精确至0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用适量正庚烷溶解并定容，并准确量取1 mL豆甾醇标液和1 mL 1.0 mg/mL胆固醇内标溶液混匀，上机测定豆甾醇和胆固醇的峰面积，采用内标物的浓度来反测豆甾醇标准溶液Ⅱ的浓度，即得浓度为0.471 8 mg/mL。

1.3 仪器分析条件

色谱柱温度：270 ℃；进样口温度：280 ℃；检测器温度：290 ℃；氮气和流速：30 mL/min，分流比：20∶1。

1.4 实验方法

本实验方法参照 GB/T 25223—2010《动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法》。

1.4.1 皂化：称取0.25 g(精确至0.00 01 g)的油样于平底烧瓶中，加入1 mL 1 mg/L的胆固醇标准溶液，混匀，加入5 mL 1.2 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，混匀，置于70 ℃水浴锅中搅拌皂化至溶液澄清透明(约15 min)。

1.4.2 氧化铝层析提取不皂化物：向层析柱倒入10 mL乙醇，并称取10 gⅠ级氧化铝分次倒入层析柱中，再用10 mL乙醇将层析柱中的氧化铝洗入层析柱中。用5 mL乙醇稀释皂化液，并移取5 mL皂化液，到装好的层析柱中，用250 mL平底烧瓶收集流出液，流速为2 mL/min，待皂化液流完后，加入5 mL乙醇洗脱，待流尽，加入30 mL乙醚继续洗脱。将收集的洗脱液旋转浓缩至干，用少量乙醚溶解平底烧瓶的目标物。此样品称为层析样品。

1.4.3 薄层色谱分离甾醇：将氧化铝层析后提取的不皂化物乙醚溶液，用平头微量注射器吸取溶液(共200 μL)点在薄层板下边缘2 cm处，样液点成圆点，但直径不超过3 mm，圆点两端距离边缘至少留出3 cm间隙。吸取50 μL胆固醇标准溶液在距离边缘1.5 cm处，左右各点一点。在展开槽中加入大约100 mL展开剂。将板放入展开槽中展开，直到溶剂到达上边缘。取出薄层板，在通风厨中挥干溶剂，而后将薄层板放入含有碘单质的烧杯中，用盖子盖好，用吹风机加热加快碘单质挥发，待薄层板中的物质完全显色后，用铅笔快速标记出所需要的甾醇范围，用刀片刮下标记的硅胶层，并收集到已准备过滤的滤纸上，加入0.5 mL乙醇，5 mL乙醚对硅胶洗提3次，用旋转蒸发器将乙醚提取物浓缩至干，用1～2 mL正庚烷溶解目标物。此样品称为薄层样品。

1.5 结果计算

1.5.1 校正系数的测定

甾醇标准溶液进样1 μL，确定各甾醇(胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇)出峰时间。豆甾醇标准品溶液Ⅰ进样1 μL，重复进样3～5针，得到内标物胆固醇和豆甾醇的峰面积。

校正系数f的计算公式：

式中：f为校正系数；A内为胆固醇内标物的峰面积；A标为豆甾醇标准品峰面积；C内为内标溶液胆固醇浓度/mg/mL；m标为配制标准品溶液时豆甾醇标准品的取用量/mg；0.99为内标物胆固醇的纯度；0.95为标准品豆甾醇的纯度。

1.5.2 甾醇含量计算

式中：P总为甾醇总量/mg/kg；f为校正系数；0.99为内标物胆固醇的纯度；A甾醇酯为油样中植物甾醇峰面积之和；m油样为油样的取用量/mg；1 000为单位换算系数。

2 结果处理与讨论

2.1 前处理讨论

本实验在国标的基础上进行了优化，国标中使用价格较昂贵的胆甾烷醇或桦木醇做内标物，且没有做内标物和主要甾醇的校正实验，而本实验因植物油中胆固醇含量很少且便宜而被选做内标物，并进行了校正实验，使得结果更准确。国标前处理一个样品大约需要7～8 h，而优化后的方法处理一个样品则只需要50 min，大大地缩短了时间，可进行大批量样品处理。

2.2 色谱图

甾醇标准样出峰色谱图如图1所示。图1为甾醇标准样出峰色谱图，样品可根据其出峰时间确定甾醇种类，胆固醇和豆甾醇出峰色谱图如图2所示。图2为内标物胆固醇和豆甾醇标准溶液Ⅰ的出峰色谱图，根据胆固醇和豆甾醇各自的峰面积，利用2.1 中校正系数计算公式，得出f=1.106 9。

图1 甾醇标准样出峰色谱图

图3和图4分别为玉米油氧化铝层析后和硅胶薄层后的甾醇出峰色谱图，很显然，氧化铝层析后玉米油中主要的甾醇峰面积明显大于薄层后的，这跟进样溶液中各甾醇含量有关，其余没有什么不同。同时，国标中的样品都加入了价格昂贵的硅烷化试剂，而在本实验中则不加，不影响样品中的甾醇含量测定，因为硅烷化试剂只是起到提高检测灵敏度的作用。

图2 胆固醇和豆甾醇出峰色谱图

图3 层析后玉米油甾醇色谱图

图4 薄层后玉米油甾醇色谱图

2.3 重复性实验

对同一菜籽油和玉米油分别按照氧化铝层析法和硅胶薄层法平行进行3次实验，方法重复性实验见表1。

表1 方法重复性实验

由表1可知，分别采用氧化铝层析法和硅胶薄层法分别对菜籽油和玉米油平行进行3次实验，RSD%都在0.012%～3.4%，说明两种方法的重复性较好。由表1和“3.2色谱图”中图3和图4图可见，处理同一油样，其氧化铝层析后和硅胶薄层后的甾醇含量变化不大，图谱中各甾醇分离效果好，除了主要甾醇峰面积大小有差异，其余没什么不同。这说明样品皂化液经氧化铝层析后提取的不皂化物中，主要含甾醇，且甾醇种类主要为菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇，其他物质并不影响主要甾醇含量的测定。因此将植物油甾醇检测方法进行简化和优化，其步骤为：皂化→氧化铝层析提取不皂化物→浓缩→上机检测。

2.4 准确性实验

以菜籽油为本底，向其加入一定量的豆甾醇标准溶液Ⅱ，按照优化后的方法进行实验，方法加标回收率实验见表2。

表2 方法加标回收率实验

由表2可知，豆甾醇加标回收率在94.0 7%～104%。由此可证明，本实验方法对测定植物油中甾醇含量具有较好的准确性。

3 结论

本研究通过参照GB/T 25223—2010方法进行植物油中甾醇含量的测定，通过比较氧化铝层析后和硅胶薄层后的重复性实验可知，同一样品经氧化铝层析后和硅胶薄层分离后的甾醇含量变化很小，其实验重复性RSD为0.012%～3.4%。故将GB/T 25223—2010方法的前处理进行了简化和优化，不但大大缩短了时间，而且豆甾醇加标实验回收率为94.07%～104%；说明优化后的方法快速、准确。

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