COX Ⅳ的表达与结直肠癌患者预后的相关性

张 坤,雷海录

(1解放军第四五一医院肝胆普外科,西安 710054;2西安财经学院校医院;*通讯作者,E-mail:18165297598@163.com)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是胃肠道中常见的恶性肿瘤之一,发病率居高不下。世界每年新确诊的结直肠癌患者接近800万,发病率增长仅次于肺癌,是因癌症致死的第三大原因[1-3]。CRC早期症状不明显,虽然其治疗手段较多且成熟,但在改善患者的预后方面效果仍不显著[4]。因此,研究新的CRC分子标志物与CRC患者预后相关性,进而研究CRC致癌机制和制定患者个性化治疗[5]成为临床医生的迫切研究方向,也是当前医学基础研究的新方向。

线粒体功能障碍被发现与多种恶性肿瘤的发生发展有关,其中包括CRC[6]。线粒体功能障碍在癌症中的表现,大多集中在DNA的改变上,包括其数量和点突变[7-11]。Warburg[8]的研究首次发现,线粒体糖酵解是癌细胞的代谢模式之一。近来的研究发现,线粒体功能支持大部分肿瘤细胞的快速增长[9]。COX是由3个mtDNA-编码和10个基因组DNA-编码子单元组成的复杂的Ⅳ电子传递链[11,12],是线粒体功能的代表性指标[13]。结肠癌的癌前病变中观察到了COX的损伤[14,15]。CRC细胞中COX的表达显著高于溃疡性或正常结肠上皮细胞。COX作为一个整体酶,只有mtDNA-编码的子单元COX Ⅱ和COX Ⅲ在CRC中被研究[15],目前为止,COX Ⅳ在CRC的研究鲜有报道。COX的mtDNA在多种哺乳动物的细胞中呈现出显著的拷贝数和高转录活动[[16,17],但COX活动相对较低,这意味着COX Ⅳ在COX组装过程的限制作用。因此,检测COX Ⅳ的表达,是更有必要的研究。因此,本研究通过实时定量PCR和Western blot法检测COX Ⅳ在CRC组织和细胞中的表达。此外,还分析了其与CRC临床预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

从2011-12～2016-12在解放军451医院肝胆普外科住院,经手术治疗后确诊的结直肠癌患者中,随机甄选出198例并纳入预后分析研究。最后随访日期为2017年4月。这项研究经解放军451医院医学伦理委员会批准,并根据赫尔辛基宣言的道德标准执行。随访策略为术后2年内每个月1次,2年后每半年1次,5年后1年1次。生存时间是从手术后至死亡的时间。随访方式采用电话和临床随访结合的方式。本组资料失访13例。

1.2 细胞来源及组织样本

结直肠癌细胞系SW480、HCT116、COLO-320-DM、DLD-1、HT-29和LoVo均购自American Committee Type Culture Collection(ATCC),并按说明书推荐条件培养。

从上述185例(剔除失访13例)肠癌组织样本中,随机抽取23对癌组织和与之匹配的相邻癌旁组织(取材时距离癌组织至少大于2 cm),用于实时定量PCR的组织样本,其中包括男性10例和女性13例,平均年龄为73岁(44-81岁);基于组织HE染色的结果,选取了具有代表性的3对结直肠癌及对应癌旁组织(IHC显示癌组织强阳性表达和癌旁呈阴性表达的组织)用于Western blot的组织样本。

1.3 Real-time PCR法检测结肠癌细胞株中COX Ⅳ的表达

人结肠癌细胞系SW480、HCT116、COLO-320-DM、DLD-1、HT-29和LoVo均采用标准RPMI 1640培养基,于细胞孵箱常规培养。传代3次,待细胞铺板率达80%时收集细胞提取总RNA。细胞总RNA的提取实验操作按试剂盒说明书进行。肠癌及相应癌旁组织总RNA提取:根据HE染色结果,从185例肠癌组织中,选取23对组织纯度较高的配对组织,冰上匀浆处理:取50 mg肠癌及对应癌旁正常组织,加入1 ml Trizol,在无RNA酶的Eppondorf管中使用自动匀浆器,冰上充分研磨30-60 s;后续步骤按试剂盒说明书进行。使用PCR试剂盒进行Real-time PCR反应。

1.4 Western blot检测结肠癌组织及细胞株中COX Ⅳ的表达

组织、细胞株的蛋白制备严格按照组织细胞的冻存、复苏及传代等操作指南步骤进行;BCA法测定蛋白质浓度按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)推荐步骤进行;配胶与电泳本实验中所用分离胶浓度为10%。

1.5 统计学分析

本实验数据采用SPSS19.0软件,COX Ⅳ蛋白表达率与临床病理学及预后因素进行Pearson卡方检验;运用Log-rank、Kaplan-Meier和Cox进行生存分析。运用Dunnett’s多均数的比较等相应统计方法进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX Ⅳ在肠癌细胞株的mRNA转录水平及蛋白水平

首先运用实时定量PCR的方法,测量了COX Ⅳ在23对CRC配对癌和相邻癌旁组织的mRNA表达水平。在结直肠癌组织中COX Ⅳ mRNA表达水平比在相应癌旁组织明显增加(P=0.05,见图1A)。结直肠癌组织样本中COX Ⅳ的蛋白质表达含量与实时定量PCR实验的结果一致,COX Ⅳ在CRC癌组织中的表达相对高于对应癌旁组织(P=0.033,见图1C)。

图1 COX Ⅳ在肠癌组织中mRNA和蛋白表达Figure 1 COX Ⅳ mRNA and protein expression in intestinal cancer tissues

在结直肠癌细胞系中,COX Ⅳ mRNA表达水平亦明显升高,被检测的6种肠癌细胞株中,HCT116细胞中表达水平相对较高,而SW480细胞中表达水平相对较低(图2B)。COX Ⅳ蛋白质在所有6株CRC细胞系中也均有表达(见图2D)。

图2 COX Ⅳ在肠癌细胞系中mRNA和蛋白表达Figure 2 COX Ⅳ mRNA and protein expression in intestinal cancer cell lines

2.2 COX Ⅳ表达与CRC患者预后的关系

单因素Cox回归分析显示,在总生存率(OS)中,TNM分期越高(P<0.001)、较高的分化程度(P=0.010)以及高血清CEA浓度(P=0.036)为预后危险因素,与OS负相关(见表1);而在无复发生存率(RFS)中,较高的TNM分期(P<0.001)、较高的分化程度(P=0.001)及高血清CEA浓度(P=0.003)为影响预后的相关因素(见表1)。图3结果显示,在CRC患者中,无论COX Ⅳ表达低或高,与患者的总生存率(OS)及无复发生存率(RFS)均无显著差异。

表1肠癌病人术后生存影响因素的Cox比例风险回归单因素分析

Table1Coxproportionalhazardsregressionsinglefactoranalysisofpostoperativesurvivalfactorsforcolorectalcancerpatients

变量 总生存率(OS)无复发生存率(RFS)HR(95%CI)PHR(95%CI)P年龄0.851(0.557-1.298)0.4530.740(0.501-1.095) 0.132性别0.865(0.568-1.317)0.4991.068(0.723-1.579)0.741位置1.029(0.676-1.568)0.8920.885(0.600-1.306)0.539直径1.176(0.767-1.803)0.4581.078(0.731-1.592)0.704数量1.072(0.149-7.732)0.9450.806(0.112-5.814)0.83CEA1.606(1.032-2.499)0.0361.833(1.228-2.735)0.003分级1.690(1.135-2.515)0.012.330(1.439-3.773)0.001TNM分期2.344(1.538-3.574)<0.0012.376(1.613-3.501)<0.001辅助治疗0.626(0.383-1.024)0.0620.656(0.412-1.043)0.074COX Ⅳ表达0.928(0.552-1.561)0.7790.726(0.448-1.178)0.195

A. 总生存率 (OS) B.无复发生存率(RFS)图3 COX Ⅳ不同表达水平的患者Kaplan-Meier生存曲线Figure 3 Kaplan Meier survival curve of patients with COX Ⅳ different expression level

多变量Cox回归分析证实了:TNM分期(P<0.001)和分化程度(P=0.009)为影响结直肠癌患者总生存率(OS)的独立危险因素,而TNM分期(P<0.001)和分化程度(P=0.006)亦为影响结直肠癌患者无复发生存率(RFS)的独立危险因素(见表2)。结直肠癌TNM分期晚期患者的生存时间比早期患者明显缩短(HR=3.227,95%CI 1.919-5.426,P<0.001),分化程度高的患者生存时间明显缩短(HR=2.011,95%CI 1.189-3.400,P=0.009);TNM分期患者的无复发生存时间比早期患者明显缩短(HR=3.310,95%CI 1.984-5.521,P<0.001),分化程度高的患者生存时间明显缩短(HR=2.099,95%CI 1.243-3,P=0.006)。考虑到COX Ⅳ在男性和女性CRC患者的不同表达水平,进行了按性别分层的生存分析,观察到COX Ⅳ在不同性别间的表达,与预后无明显相关性(见图4)。

表2肠癌病人术后生存影响因素的Cox比例风险回归多因素分析

Table2Coxproportionalhazardsregressionmulti-factoranalysisofpostoperativesurvivalfactorsforcolorectalcancerpatients

变量 总生存率(OS)无复发生存率(RFS)HR(95%CI)PHR(95%CI)P年龄0.770(0.498-1.191)0.240.756(0.490-1.166) 0.206性别0.966(0.629-1.482)0.8720.966(0.631-1.481)0.875位置0.963(0.606-1.528)0.8720.966(0.608-1.533)0.883直径1.018(0.637-1.627)0.941.090(0.682-1.743)0.718数量0.631(0.083-4.779)0.6550.600(0.079-4.544)0.621CEA1.391(0.876-2.210)0.1621.429(0.900-2.270)0.131分级2.011(1.189-3.400)0.0092.099(1.243-3.544)0.006TNM分期3.227(1.919-5.426)<0.0013.310(1.984-5.521)<0.001辅助治疗0.329(0.180-0.602)<0.0010.338(0.194-0.589)<0.001COX Ⅳ表达1.174(0.739-1.866)0.4971.102(0.726-1.672)0.649

3 讨论

在这项研究中，检测了COX Ⅳ在结直肠癌患者组织、细胞中的表达及与预后之间的关系。我们发现，在CRC的6种细胞株中COX Ⅳ的表达升高；与癌旁组织相比，癌组织中COX Ⅳ的表达亦升高。还探讨了COX Ⅳ的表达与结直肠癌患者的预后价值的相关性。但是，观察到COX Ⅳ表达与结直肠癌患者的临床预后之间不存在显著关联。

COX是一种重要的线粒体多蛋白复合物,带有两个主要基质：氧和细胞色素C[18]。COX的mtDNA编码亚基COX Ⅰ到Ⅲ的突变,与许多肿瘤的发生和发展有关联[19-21],其中包括CRC[22,23]。在结直肠癌患者的组织和细胞中观察到COX Ⅳ的高表达。在肺癌[24]和肾细胞癌[25]中COX ⅤA表达的增加已被证实。至今的所有研究一致表明,COX表达的显著改变导致结直肠癌的发病。

COX Ⅳ在CRC中表达升高的作用机制仍有待进一步研究阐明。在多形胶质母细胞瘤(GBM)中,增加COX ⅤA的活性与替莫唑胺的化疗耐药相关[26],同时缩短患者的无进展生存期和总生存率(OS)[27]。虽然COX表达的改变在结肠癌上皮细胞的发生作用中发挥了重要作用已被证实,但是在本次研究中未检测到COX Ⅳ表达的预后价值。这些差异的一个解释是,不同的COX亚基的改变可能有助于CRC及其他消化道肿瘤发展的不同阶段,有文献证实,COX Ⅱ过表达与胰头癌预后呈正相关[28]。蛋白质组研究已证实,核编码COX亚基与mtDNA编码COX亚基的比例,在癌变的进展过程中增加,这表明COX亚基的改变可协调肿瘤代谢的重组过程[29,30]。此外,方法设计、种族地域、人口抽样、数据处理和实验方案等方面的差异也会导致此次研究的结果与其他研究之间或多或少存在误差。

按性别分层分析表明,COX Ⅳ的表达与CRC患者的OS(总生存率)或RFS(无复发生存率)无明显相关图4 COX Ⅳ不同表达水平的患者按性别分层的Kaplan-Meier生存曲线Figure 4 Kaplan Meier survival curve of patients with different expression level of COX Ⅳ stratified by sex

总之,本次的研究证明,在结直肠癌组织及细胞中COX Ⅳ表达水平明显升高。然而,本研究未检测到COX Ⅳ的表达与CRC患者的预后有任何关联。本次的研究结果有助于了解COX亚基的改变在CRC的致病进程中所起的作用。

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