嗜水气单胞菌bamA、bamB、bamD突变株的构建及其对外膜蛋白转运的影响

黄放 林向民

（1. 福建农林大学生命科学学院，福州 350002；2. 福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室，福州 350002）

细菌的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）是一类位于革兰氏阴性细菌外膜上的蛋白质，可协助细菌摄取所需的营养物，促进细菌的生长，并在细菌的生理与病理机制中扮演着重要作用［1-4］。外膜蛋白的合成、转运与正确折叠需要经历一个复杂的过程，先在细胞质内合成具有N-末端信号的前体，经由SEC系统介导穿过细胞内膜，并在分子伴侣（Skp，SurA）的作用下经过周质空间，最终在BAM（β-barrel assembly machinery）复合物的协助下正确地折叠并整合到外膜中形成β-桶状结构［5-7］。BAM复合物一般由一个外膜蛋白BamA和4个脂蛋白 BamB、BamC、BamD 与 BamE组 成［8-10］。 前 期研究发现大肠杆菌的BamA属于Omp85家族蛋白，它与BamD是BAM系统中必不可少的组成部分，在外膜蛋白转运中起着至关重要的作用［7，11］。BamB、BamC、BamD的同源物仅存在于革兰氏阴性菌，单独突变bamB、bamC和bamE基因，可引起少数外膜蛋白的错误装配。而三个重要性相对较弱的脂蛋白BamB、C、E对外膜蛋白转运的影响也各不相同，bamB的缺失对外膜蛋白的合成产生较大的影响［11-14］。此外，大肠杆菌BamA∶B∶C∶D∶E形成核心复合物，并在表面活性剂的作用下，可以分解为BamA∶B、BamC∶D和BamC∶D∶E三种复合物形式，而bamC的缺失会导致这些复合物的稳定性下降，并导致BamB与BamD对蛋白酶的敏感性增加［16］。同时在野生株中BamA易受外源的蛋白酶K的影响，bamE的缺失在一定程度可以降低其影响［17］。但在不同细菌中，BAM系统的复合物组成及其功能也存在一定差异。

目前对于BAM系统的研究大都集中于大肠杆菌及脑膜炎双球菌等少数几种细菌中，在其他细菌中的相关研究还鲜有报道。嗜水气单胞菌ATCC 7966是一株属于O∶1血清型且具有一定毒性的模式菌株［18］，BAM系统在该菌株中如何发挥调控作用尚不明确。本研究利用同源重组交换的方法成功构建嗜水气单胞菌bamA、bamB和bamD突变株，并结合质谱及Western blotting技术，研究这3个重要的蛋白对多个外膜蛋白表达及转运的影响，从而深化对BAM复合物在嗜水气单胞菌外膜转运系统中作用的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、引物 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrohilaATCC 7966由实验室保存，感受态细胞E.coliS17-1λpir与自杀载体pUTKm1均由福建农林大学张燎原老师惠赠。根据Uniprot数据库中bamA、bamB、bamD的基因序列设计相应引物（表1）。

表1 嗜水气单胞菌ATCC7966 bamA、bamB、bamD基因突变株构建的引物

1.1.2 生化试剂 限制性内切酶KpnI、SacI、ScaI和T4 DNA连接酶购自赛默飞世科技有限公司；DNA聚合酶和DNA marker为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega公司；基因组小量制备试剂盒购自天根生物科技公司；琼脂糖购自生工生物工程有限公司；卡那霉素（Kan）氨苄青霉素（Amp）均购自生工生物工程有限公司。

1.1.3 培养基 胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 以提取的嗜水气单胞菌ATCC 7966基因组DNA 为模板，利用相关引物进行 PCR扩增反应，PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测后将获得的特异性DNA条带用胶回收试剂盒回收。

1.2.2 基因突变株的构建 根据BamA、B、D基因序列分别设计引物（引物序列详见表1），以嗜水气单胞菌为模板，PCR扩增片段，扩增后的片段进行双酶切（SacI、ScaI），经再次回收后与酶切后的自杀载体pUTKm1连接。连接产物转化至E.coliS17-1λpir，从而完成同源重组载体的构建。双亲本杂交参考张燎原方法进行操作［18］。

双亲本杂交利用的原理为同源重组单交换，目的是将同源重组载体整合进入嗜水气单胞菌的基因组中，具体操作如下：分别过夜培养嗜水气单胞菌 ATCC 7966 和E.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD，以1∶20（V/V）的接种量转接至新鲜LB液体培养基进行培养，OD600nm至0.8（约3 h），取100 μL 嗜水气单胞菌培养液和 400 μLE.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD培养液至离心管中进行混合，在4℃条件下进行离心（4 000 r/min），加入100 μL新鲜LB液体培养基重悬浮菌体，取50 μL重悬浮菌液点至预先准备好的放有0.22 μm膜的平板上，正置培养12 h后，用1 mL LB液体培养基将膜上培养的菌体洗涤下来，取100 μL洗涤下的菌液涂布在含终浓度100 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，长出的菌落经特异性引物进行PCR验证。

1.2.3 膜蛋白的提取 分别挑取嗜水气单胞菌ATCC 7966野生株与突变株的单克隆菌落于5 mL的LB培养基，30℃震荡过夜培养，以1∶100（V/V）转接到100 mL LB液体培养基中扩大培养，30℃培养至OD600nm为1.0，8 000 ×g离心10 min收集菌体，超声破碎菌体，离心收集上清。将所得上清经0.45 μm滤膜过滤，滤液于超速离心机中以29 300 r/min离心60 min，沉淀用适量的PBS缓冲液溶解，-20℃保存。

1.2.4 差异蛋白的SDS-PAGE分析与质谱鉴定 取经超速离心法得到野生株与突变株的膜蛋白进行SDS-PAGE分析，分析条件为恒压90 V，分离胶浓度为10%，上样量为20 μL电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端为止，电泳后用考马斯亮蓝R250染色。将蛋白胶上所选择的差异条带切下，先用100 μL Milli-Q水震荡洗涤两次，再加入脱色液（50 mmol/L碳酸氢铵/乙腈=1∶1）至胶粒蓝色褪去；加入150 μL纯乙腈脱水至胶粒完全变白，真空干燥；加入100 μL的10 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），56℃水浴60 min；冷却到室温后，吸干，快速加入100 μL的55 mmol/L碘乙酰胺（IAA），置于暗室45 min；后依次用25 mmol/L碳酸氢铵、50%乙腈和100%乙腈，脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干；后用Trypsin酶液消化过夜，加入2%三氟乙酸（TFA）终止反应，使TFA终浓度为0.1%，振荡混匀，离心，酶解的肽段用LC-LTQ XL质谱仪鉴定蛋白。

1.2.5 突变株bamA、B、D的Western blot分析 将敲除菌中提取的膜蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，进行印记杂交，将凝胶、滤纸、PVDF膜置于盛有转膜缓冲液的容器中，浸泡5 min，恒流1.3 mA，转膜30 min，将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭60 min，加入相应外膜蛋白抗体（1∶2 000稀释）4℃孵育过夜，洗涤。后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，室温孵育60 min，洗涤，显色。

2 结果

2.1 bamA（AHA_1181）、bamB（AHA_1762）、bamD（AHA_4074）基因片段的扩增

如图1所示，利用DNA聚合酶从嗜水气单胞菌ATCC 7966基因组DNA中PCR扩增约1 060 bp、750 bp、580 bp的目的基因片段。对照Marker可以看出 PCR扩增出bamA（1 060 bp）、bamB（750 bp）、bamD（580 bp）的特异性条带，确定PCR扩增出的条带为所需的基因片段。

图1 bamA、bamB、bamD基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.2 自杀载体pUTKm-bamA、bamB、bamD的构建

PCR产物经限制性内切酶完全消化后，与载体酶切后回收的片段连接，转化感受态细胞E. coliS17-1λpir，在50 μg/mL卡那霉素 LB 平板上挑选克隆。通过酶切（图2）和测序鉴定，获得正确重组子自杀载体pUTKm-bamA-D，再通过双亲本接合转移，在100 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL卡那霉素抗性LB平板上筛选，得到接合转移子。

图2 pUT-bamA-D双酶切电泳图

2.3 bamA、B、D突变体的PCR验证

经过抗性平板的初步筛选，筛选到bamA、bamB、bamD突变菌株。为了进一步确定bamA、B、D基因是否已经被插入突变，分别在BamA、B、D的上游设计一条引物（PbamA1、PbamB1、PbamD1），在自杀载体上设计一条引物（P4）。以野生株和突变株的嗜水气单胞菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果（图3）发现可以分别扩增出特定长度的片断，而对照为阴性图3。同时将扩增产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序，测序结果显示正确。综上结果证实pUT-bamA、pUT-bamB、pUT-bamD载体已经插入嗜水气单胞菌ATCC 7966基因组中。

图3 突变株bamA、B、D的PCR验证

2.4 突变株差异蛋白的质谱分析结果

同野生株嗜水气单胞菌外膜蛋白进行比较，突变菌株bamA、bamB、bamD存在差异表达蛋白（图4），对这些差异蛋白进行质谱分析，共鉴定到7个差异蛋白，其中5个为外膜蛋白，2个为位于内膜上的蛋白酶（表2）。

图4 嗜水气单胞菌野生株与突变株膜蛋白的SDS-PAGE图谱

2.5 bamA、B、D突变后对相关蛋白表达和转运的影响

为了研究bamA、B、D突变后的变化，选取实验室已有的 Ferrichome receptor（A0KQZ1）、Maltoporin（A0KHF6）、Colicin I receptor（A0KQ46）、TonB-dependent copper receptor（A0KFG8） 外膜蛋白抗体，研究突变菌株bamA、B、D在胞浆和膜蛋白水平上，对蛋白的表达与转运的影响。结果发现，与野生株嗜水气单胞菌相比较，bamA、bamD突变后所有的相关蛋白都处于下调的状态，特别对 Colicin I receptor与 Maltoporin、TonB-dependent copper receptor三种外膜蛋白的影响最大。通过对细菌胞浆组分的western blotting结果分析，发现所有的检测蛋白也都下调，而且基因的缺失对Ferrichome receptor与 Colicin I receptor、TonB-dependent copper receptor的表达影响较大，对Maltoporin的表达影响较小。但不同突变株对不同外膜蛋白的影响有差别，例如Colicin I receptor在bamD突变菌中胞浆中的表达明显降低，而Maltoporin则在bamB突变菌中显著下调（图5）。

表2 LC-MS鉴定SDS-PAGE分离嗜水气单胞菌与突变株bamA、bamB、bamD外膜蛋白组的差异蛋白

图5 野生株（CK）与bamA、bamB、bamD突变株在膜蛋白水平与胞浆蛋白水平上多个相关蛋白的Western blotting

3 讨论

细菌的外膜蛋白位于细胞与外界环境的交界处，在信号传导、毒力侵染、细菌耐药、抗逆性等多个生物学功能中起重要作用。因此，BAM系统复合物的正常运转可确保外膜蛋白的正确折叠和转运，对维持细菌的正常生长至关重要。Charlson等［13-14，19］在大肠杆菌中发现BamA 和BamD是细菌外膜蛋白折叠和转运的必须蛋白，bamB基因的突变，可以使BAM复合物受到损伤，部分外膜蛋白的分泌减少；而Fardini 等［12］则认为沙门氏菌中的BamB并不是一个重要蛋白，当敲除bamB基因后，仅对BAM复合物系统造成轻微损伤。此外，研究发现脑膜炎双球菌中bamC和bamE的突变，对BAM复合物系统影响并不大，并不是细菌生存所需的关键蛋白［20］。

鉴于以往未见嗜水气单胞菌中BAM系统对外膜蛋白转运影响的报道，本研究利用分子生物学方法敲除该菌BAM系统中的重要组成亚基bamA，bamB和bamD。首先比较这些敲除菌株对细菌膜蛋白的表达影响，SDS-PAGE发现7条差异条带，质谱鉴定结果显示至少有5个外膜蛋白，并利用Western blotting验证部分蛋白的变化。结果发现，嗜水气单胞菌bamA、bamB和bamD的缺失突变均引起本研究中选取的4个外膜蛋白在细胞膜水平上的表达下降，除了BamD在Ferrichrome receptor的转运中起较为重要的作用以外，BamA、BamB和BamD对其他外膜蛋白转运均起重要的作用；研究还发现，在细菌胞浆组分中，不同BAM复合物亚基似乎对特定外膜蛋白表达的影响也有所不同，例如BamB蛋白在外膜蛋白Maltoporin的表达中起决定性作用，BamA次之；Colicin I receptor和 Ferrichrome receptor的表达，则主要取决于BamD蛋白；而BamA，BamB和BamD在TonB-dependent copper receptor与BamD的表达中起相近的贡献，提示BAM系统的变化不仅影响外膜蛋白在膜蛋白组分上的转运，还可能通过某种途径影响外膜蛋白的调控表达。值得提出的是，在大肠杆菌中敲除bamA或者bamD基因以后，均导致细菌外膜蛋白不能正确折叠进入外膜而导致细菌死亡，而本研究中敲除嗜水气单胞菌的相应基因后只引起细菌生长略缓慢（数据未显示），并未造成细菌的致死，这可能与试验中pUTKm载体介导的突变并未完全无痕敲除目的基因有关，也有可能由这两个蛋白在BAM系统中的作用与大肠杆菌等细菌的差异导致。以上研究与在大肠杆菌中相应复合物功能的结论有略微不同，提示嗜水气单胞菌BAM转运系统可能还具有特定的外膜蛋白转运与折叠特性。

4 结论

本研究成功构建了bamA、bamB、bamD缺失突变株，SDS-PAGE分析发现7条差异条带，质谱技术鉴定获得至少5个差异外膜蛋白，进一步的Western blot分析发现bamA、bamB和bamD的缺失均能不同程度地影响嗜水气单胞菌外膜蛋白的转运。

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