转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

柳娜　杨文雄

摘要：研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物，用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因，利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。

关键词：转录因子；DREB1A基因；植物表达载体

中图分类号：Q943.2 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）11-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.009

Cloning of Transcription Factor DREB1A Gene and Construction of Plant Expression Vector

LIU Na， YANG Wenxiong

（Institute of Wheat， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：To research the function of the transcription factor DREB1A in plant tolerance to osmotic stress， a pair of primers was designed according to the sequence of DREB1A gene in GenBank databases. The DREB1A gene was cloned from Arabidopsis thaliarra by the method of PCR. By the method of Recombinant DNA Technology， plant expression vector pCAMB1A1300-DREB1A was successfully constructed. The results laid a foundation for further research on genetic transformation using DREB1A gene.

Key words：Transcription factor； DREB1A gene； Plant expression vector

干旱、盐碱和低温等逆境是影响作物生长发育的主要限制因子，改善环境胁迫的耐受性对提高作物产量具有重要意义[1 - 3 ]。环境胁迫能诱导许多植物基因的表达，有些基因的表达产物可直接增强胁迫耐性，有些可以感应和转导胁迫信号调控基因表达[4 - 5 ]。因此，抗逆相关基因的克隆、表达调控及功能分析等研究，为作物抗逆育种提供了潜在的有效途径。干旱又是制约甘肃小麦生产的首要因素，提高小麦对干旱胁迫的耐受性来增加小麦产量，将极大地提高甘肃应对粮食安全问题的能力。加强具有抗旱基因资源的发掘和创新，开展抗旱生理和遗传学研究，利用基因工程技术实现不同物种间抗旱基因的转移，提高植物的耐旱能力，是目前研究的热点之一[6 ]。植物的耐旱性是一个复杂的多基因控制系统，而转录因子有一部分与抗逆性有关，参与渗透胁迫的信号转导和功能基因表达调控，在植物抗渗透胁迫反应中起关键作用[7 - 11 ]。已有的研究表明，DREB是个小基因家族，编码3个相关的转录因子， DREBlA是这个小基因家族的重要成员之一，它对抗渗透胁迫基因的启动起着“ 主开关”的作用， 在逆境胁迫下主动调控相关基因的表达， 并在胁迫信号传递中起重要作用。我们从拟南芥中克隆转录因子DREBlA，并构建由CaMV35S启动子调控的植物表达载体，旨在为进一步利用DREBlA基因做小麦遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚生态型拟南芥幼苗由甘肃省农业科学院小麦研究所种质创新实验室提供。pMD19-T vector、pCAMBIA1300-N-eGFP载体、大肠杆菌菌株DH5a均购自大连宝生物工程有限公司。

Taq酶、氨卞青霉素、卡拉霉素、IPTG、X-gal、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒等其他试剂均购自TaKaRa公司，引物合成和基因测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥叶片基因组 RNA 的提取 使用植物基因组试剂盒提取拟南芥叶片基因组RNA，然后通过RT-PCR反转录成cDNA。以反转录的cDNA 为模板，用设计好的上下游引物扩增DREB1A基因，采用1%的琼脂糖凝胶检测 DNA 的完整性。

1.2.2 DREB1A基因克隆及載体构建 根据Genebank中拟南芥DREB1A基因序列（登录号：EF156749），应用Primer Premier 5.0软件分析其内部酶切位点情况。设计1对引物，并根据后续构建植物表达载体的需要，在上游引物一端加入l个XbaI位点，在下游引物一端加入了BamH I位点。设计PCR引物如下：上游引物D1：5GCTCTAGA ATGAACTCATTTTCTGCT-3XbaI；下游引物D2：5GCCCTAGG GTCGCATCACACATCTC 3 BamHI。PCR反应体系总体积为50.0 μL，包括5xbuffer 10.0 μL、10 mmol/L上游引物1.0 μL、下游引物1.0 uL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，Primer STAR 1.0 μL加ddH2O至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性2.0 min、94 ℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72 ℃ 1.0 min。35个循环后72 ℃延伸10.0 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖电泳检测后，扩增片段大小为561 bp（图1）。将扩增片段用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化（操作程序根据试剂盒说明书进行，回收后的DNA片段加A尾。连接到克隆载体pMD19-T载体，将经PCR检测和XbaI/BamH I双酶切鉴定呈阳性的克隆命名为T-DREB1A，送交北京六合华大基因科技股份有限公司测序，采用DNAMAN软件分析比对测序结果。

1.2.3 拟南芥DREB1A基因表达载体的构建 将测序合适的T-DREB1A载体质粒用核酸内切酶XbaI和BamH II酶切，回收DREB1A片段。同时将pCAMBIA1300-N-eGFP载体用此2个酶切，回收载体。回收双酶切产物，用T4DNA 连接酶将DREB 1A片段接到pCAMBIA1300载体中。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。菌液PCR鉴定构建的DREB1A基因植物表达载体，并将阳性克隆送交北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 DREB1A基因的克隆与测序结果

分别以DI、D2为上下游引物，以cDNA模板，扩增出561 bp的特异带，与预期的DREB1A基因大小相符（图1）。将扩增片段链接到克隆载体pMD19-T，测序后与GenBank中的拟南芥DREB基因序列进行比对，结果表明2个序列完全一致，说明获得的拟南芥DREB基因编码区是正确的，没有发生碱基变化，可以用来构建植物表达载体。

2.2 植物表达载体p1300-DREB1A构建

用前向带有XbaI和反向带有BamH I酶切位点的拟南芥DREB基因引物，以pMD19-T-DREB 质粒为模板，经内切酶切割回收目的片段。目的片段回收纯化后，用XbaI和BamH I酶切，连接到用相同酶切回收后的表达载体pCAMBIA1300上，转化E.coli DH5α，获得pCAMBIA1300-DREB表达载体（图2）。对重组质粒进行PCR鉴定，扩增出一条长约561 bp的目的基因条带（图3）。将阳性克隆测序，序列比对结果正确，说明拟南芥DREB 基因表达载体构建成功。

3 结论与讨论

用PCR方法从拟南芥中克隆了DREB1A基因，序列分析发现克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列（EF156749）的同源性为99.85%。利用基因重组技术成功构建了由CaMV35S启动于调控的植物表达载体p1300-DREB1A.为进一步利用DREB 1A基因综合改良植物抗旱性奠定基础。

植物感受外界干旱、高盐、激素、病害及体内细胞发育等信号，通过一系列信号传递激发转录因子，转录因子与基因启动子区域的顺式作用元件结合后，激活RNA聚合酶Ⅱ转录复合物，从而启动基因的的转录表达，最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面做出适合的调节反应。DREB转录因子参与对干旱 、高盐和低温等逆境胁迫的应答，介导植物非ABA依赖的渗透胁迫信号的传递。DREB 转录因子可以和DRE顺式元件或具有DRE核心序列的元件特异性结合，调控下游相关基因的转录表达，提高对低温、干旱和高盐的抗性。因此，DREB类转录因子在基因的表达调控方面起着非常重要的作用。目前，已从不同的作物中克隆到这类转录因子，并对其功能进行了研究。

参考文献：

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（本文责编：杨 杰）