新型核素分子探针18F-NT靶向前列腺癌的实验研究

邹开力，唐永祥，周明，李建，胡硕

（中南大学湘雅医院 PE中心，湖南 长沙 410008）

前列腺癌是老年男性常见恶性肿瘤，其发病率和病死率都很高。在美国，老年男性的健康受到前列腺癌的严重威胁，其发病率位居男性恶性肿瘤的首位。根据美国最新数据显示，2016年美国前列腺癌新发病例以及死亡人数分别为180 890人和26 120人，占男性癌症死亡率的第2位[1]。在欧洲，其死亡率也位居癌症死亡率的第3位。在中国，随着老龄化时代的到来、饮食习惯的变化，前列腺癌的发病率和死亡率呈现逐年上升趋势，增长速度超过欧美。在前列腺癌诊治过程中，如何早期发现肿瘤，以及对前列腺癌患者进行准确的分期、分级判断对于治疗方案制定和预后及时评估都有着重要的意义。由于前列腺癌的肿瘤异质性，超声和MRI等常规的影像检查方法不能对疾病的分期尤其治疗后复发再分期进行有效地评估[2-3]。近年来，随着分子影像技术不断发展，针对肿瘤特异性生物靶点和代谢途径的特点，进行精准诊断和临床分期，受到研究者和临床专家的的重视和认可。神经降压素（Neurotensin,NT）是一种由13个氨基酸组成的神经内分泌肽，有降压、镇痛、刺激垂体腺分泌激素、降低体温、调节情绪、调节胃肠等功能。近年的研究表明[4]，NT在多种肿瘤组织和细胞中有高表达，NT及其主要受体NTR1介导的信号途径对于肿瘤的发生和发展进程有明显的促进作用。NT有3种受体，神经降压素受体1（NTR1）、神经降压素受体2（NTR2）和神经降压素受体3（NTR3），其中NTR1被证明在前列腺癌高表达，而在相应正常前列腺组织中则很少表达[5-6]，此外，NT通过NTR1发挥其促肿瘤增殖作用，且3种受体中NTR1与配体NT的亲和力最强。本研究制备一种靶向NTR1的新型PET分子显像剂18FNT，用前列腺癌细胞特异性结合实验和荷瘤裸鼠生物分布实验，来验证其对NTR1的靶向性，为今后的前列腺癌个体化靶向在体显像及治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和实验动物

人前列腺癌细胞系PC3细胞购于中国科学院上海细胞库，裸鼠购自湖南斯莱克景达公司。

1.2 设备与试剂

1.2.1 设备 Qilin回旋加速器（美国通用电气公司），Fastlab FN型正电子药物合成模块（美国通用电气公司），1260型高效液相色谱仪、Biocan Flow Count放射性检测器、紫外检测器（美国Agilent公司），Bioscan system 2000型薄层色谱扫描仪（美国Bioscan公司），HH6603型γ放射免疫分析仪（北京核海高技术有限公司），EX125DZH型电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）。

1.2.2 试剂和材料 NT（前体）（美国北卡罗来纳大学惠赠），乙腈（美国TEDIA公司），QMA（Sep Pak Light）、C18（Sep Pak Plus）（ 美 国 Waters公 司 ），色谱柱[德国MN公司VP NUCLEOSIL 100-7-C18（5μm，16×250mm）]，Millex GS 0.22μm 除菌过滤器（美国Millipore公司），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），磷酸盐缓冲液（PBS）（武汉博士德生物技术有限公司），其余试剂均为国产。

1.3 实验方法

1.3.118F-NT的制备 取300μg前体NT用1ml乙腈溶解，加入500μl pH=4的醋酸缓冲液和30μl 2mmol氯化铝AlCl3后转移到模块反应管中。18F-（700mCi）经0.3ml 0.9%氯化钠NaCl溶液淋洗到反应管后80℃反应10 min，随后体系经HPLC纯化（30%乙腈）并收集产品峰至中转瓶，最后再经固相萃取得最终无色澄清产品注射液（60mCi）。

1.3.218F-NT的质控 用pH试纸检测18F-NT的pH值。取0.5ml稀释后的产品溶液（0.2mCi）和0.5ml NT前体溶液分别置于不同的进样瓶中，用HPLC法分析产品纯度，以0.1% TFA、30∶70（体积比）的乙腈∶水体系做流动相为30%乙腈溶液。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞培养 将人前列腺癌细胞PC3置于10%FBS的RPMI 1640完全培养基的培养瓶中，放入37℃、5% CO2的培养箱常规传代培养。实验前以1×105个/孔将细胞种入12孔板中，每孔加2 ml RPMI 1640培养液继续培养。

1.4.2 细胞结合实验 取培养PC3细胞的12孔板，每孔约含1×106个的对数生长期细胞，做PC3的18F-NT细胞结合实验。分3组，每组3个复孔，分别为实验组、阻断组和对照组（游离18F离子）。具体步骤如下：①培养板中的细胞去上清液，用PBS洗涤3次。②每孔加0.5 ml培养液，阻断组加入浓度为1 000 μg/ml的NT 0.2 ml，其他两组加0.2 ml PBS缓冲液，室温25℃下孵育30 min。③实验组、阻断组分别加入放射性活度浓度为0.185 MBq/ml的18F-NT 4 ml，对照组加入同等放射性活度浓度的游离18F 4 ml，每孔放射性活度0.74 MBq，室温25℃下孵育60 min。④吸取上清液，用PBS缓冲液洗涤3次，以去除细胞外放射性物质。洗涤完毕后，每孔加入1 mol/ml的NaOH 0.5 ml裂解细胞，将每孔物质移入试管。⑤用γ计数仪读取每管放射性计数值。

1.5 动物实验

1.5.1 复制动物模型 将处于对数生长期的PC3（细胞消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度接近于1×107个/ml）接种0.2ml于裸鼠颈背部皮下，待肿瘤直径0.8～1.0cm时用于生物学分布实验。

1.5.218F-NT生物学分布 实验6只PC3荷瘤裸鼠，随机分成两组（每组3只），实验组尾静脉注射0.2ml生理盐水，阻断组尾静脉注射0.2ml的NT，30min后每只裸鼠尾静脉注射浓度为37MBq/ml的18F-NT 0.2ml。1h后摘除眼球取血，用脱臼法处死小鼠。分离肿瘤、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、小肠、肌肉、骨、肺、脑等器官组织，分别称重，测定放射性计数，计算%ID/g。

1.5.3 HE染色 将分离出的PC3肿瘤组织以及湘雅医院病理科所取正常前列腺组织，用中性甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋后切片，对切片行常规HE染色。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 18F-NT质量控制及稳定性

HPLC分析结果显示，18F-NT的出峰时间为14 min，标记率为8.6%，标记后6 h放化纯仍高达99%。

2.2 18F-NT细胞结合实验结果

孵育1 h后，PC3细胞系1h18F-NT计数值：实验组（5825.00±1074.52）/min，阻断组（1941.66±173.58）/min，对照组（170.33±56.59）/min。实验组是阻断组的3倍，两组间比较的差异有统计学意义（t=7.227，P=0.003）。实验组约是对照组的34.34倍，两者间比较差异有统计学意义（t=9.102，P=0.001）。

2.3 18F-NT在荷瘤小鼠体内的生物分布

两组在注射18F-NT后1 h的生物学分布显示（见表1）：实验组、阻断组的血液摄取值分别为（0.10±0.06）和（0.14±0.11）%ID/g，在两组中均较低，说明18F-NT在血液中清除快。肾脏摄取较高，实验组和阻断组分别为（0.84±0.20）和（0.76±0.46）%ID/g，表明该标志物主要经肾脏排泄。实验组肿瘤和阻断组移植瘤放射性摄取差异明显，分别为（1.02±0.49）和（0.21±0.03）%ID/g，差异有统计学意义（t=2.815，P=0.049）。18F-NT在其他各正常组织器官的分布均低于肿瘤（见图1和表2）。表2中，肿瘤/肾脏的T/NT值为（1.29±0.83），因为放射性药物从肾脏排出。肿瘤与其余各正常组织器官的比值T/NT均大于6，其中肿瘤/肌肉的T/NT为（6.97±1.44），说明注射后1 h的放射性本底较低；肿瘤/脑的T/NT最高，为（38.27±19.9），说明脑组织摄取最少。

表1 瘤鼠体内注射18F-NT后1 h体内分布 （n=3，%ID/g，±s）

表1 瘤鼠体内注射18F-NT后1 h体内分布 （n=3，%ID/g，±s）

注：%ID/g经时间衰减校正

组别 血液 心脏 肝脏 脾脏 肾脏实验组 0.10±0.06 0.10±0.10 0.06±0.007 0.05±0.01 0.84±0.20阻断组 0.14±0.11 0.08±0.05 0.08±0.07 0.16±0.24 0.76±0.46 t值 -0.489 0.283 -0.642 -0.831 0.279 P值 0.650 0.791 0.556 0.453 0.794组别 肌肉 骨 肠 脑 肺 肿瘤实验组 0.15±0.07 0.16±0.14 0.18±0.069 0.03±0.019 0.13±0.03 1.02±0.49阻断组 0.09±0.11 0.06±0.04 0.17±0.22 0.04±0.07 0.23±0.10 0.21±0.03 t值 0.71 1.241 0.083 -0.315 -1.584 2.815 P值 0.517 0.282 0.938 0.769 0.188 0.049

图1 荷瘤鼠体内注射18F-NT后1 h体内分布经时间衰减校正

表2 肿瘤与各正常器官组织对18F-NT摄取的比值

注：T/NT为实验组中肿瘤与各组织摄取18F-NT的比值

2.4 肿瘤HE染色

常规HE染色，正常人前列腺组织见图2，PC3荷瘤鼠肿瘤组织见图3。

图2 正常人前列腺病理检查结果 （HE×200）

图3 裸鼠PC3肿瘤病理检查结果 （HE×200）

3 讨论

前列腺癌的诊断、分期，尤其是治疗后生化复发的影像学证据，决定患者的治疗方案，目前还没有十分满意的特异性诊断手段。研究表明[7]，NTR1在正常的前列腺细胞中不表达，而在前列腺癌中表达。SEHGAL等[8]研究表明，在缺乏雄激素的晚期前列腺癌中，NT/NTR能促进肿瘤的生长。在TAYLOR等[9]的细胞实验中，随着前列腺癌细胞致瘤潜力的增加，NTR1的表达也随之增加。有学者[10]证实，在前列腺癌细胞系PC3有NTR1的过表达，SUTHERLAND等[11]研究也表明，NTR1在前列腺癌细胞系PC3有过度表达。因此NTR1有可能成为新型显像靶点。本研究临床常用的核素18F标记与NRT1特异性结合的NT，制作完成正电子显像剂，通过细胞结合实验，结果显示，PC3细胞实验组对18F-NT的摄取计数值为5 825/min，阻断组的摄取计数值为1 941/min，对照组的摄取计数值为170/min，说明前列腺癌PC3细胞对18F-NT有极强的摄取能力，且该摄取能力可被未标记的NT有效阻断，说明NT与NTR1之间的结合是特异性的。

两组荷瘤鼠在注射18F-NT后1 h，血液摄取值较低[实验组（0.10±0.06）%ID/g，阻断组（0.14±0.11）%ID/g]，说明18F-NT在血液中清除较快，血本底很低。心脏、肝脏、脾脏、肺、肠、脑等脏器的摄取值与血本底接近。肾脏药物积聚较多[实验组（0.84±0.20）%ID/g，阻断组（0.76±0.46）%ID/g]，说明18F-NT主要通过肾脏排泄。两组移植瘤中，阻断组摄取值[（0.21±0.03）%ID/g]大大低于实验组[（1.05±0.46）%ID/g]，表明NT能有效阻断组18F-NT的摄取，进一步说明18F-NT与NTR1之间的结合特异性。综上所述，18F-NT对于前列腺癌将是一个理想的特异性靶向显像剂，尤其可以作为雄激素非依赖型前列腺癌原发灶、转移灶的显像诊断的一种新型分子探针。

本研究中，18F-NT制配步骤简单，放化纯度高，体外稳定性好。综合细胞结合实验和荷瘤鼠生物分布实验分析，笔者认为，18F-NT对NTR1有较好的特异性，在移植瘤中的摄取较高，其T/TN值较高，1 h后肿瘤摄取值甚至比肾脏还高，可为后续前列腺癌（包括非雄激素依赖前列腺癌转移）的动物PET显像以及临床PET显像研究提供实验依据，为远期的前列腺癌临床分期与再分期以及治疗方案制定与调整提供帮助。

[1]SIEGEL R L,MILLER K D,JEMAL A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1): 7-30.

[2]KIRBY R.Optimising the management of early prostate cancer[J].Practitioner,2014,258(1770): 15-18.

[3]李颖,张彤迪,宋奕宁,等.经直肠超声与磁共振显像对前列腺癌诊断价值的对比研究[J].中华超声影像学杂志,2010,19(6):549-550.

[4]DUPOUY S,MOURRA N,DOAN V K,et al.The potential use of the neurotensin high affinity receptor 1 as a biomarker for cancer progression and as a component of personalized medicine in selective cancers[J].Biochimie,2011,93(9): 1369.

[5]VALERIE N C,CASAREZ E V,DASILVA J O,et al.Inhibition of neurotensin receptor 1 selectively sensitizes prostate cancer to ionizing radiation[J].Cancer research,2011,71(21): 6817.

[6]ELEK J,PINZON W,PARK K H,et al.Relevant genomics of neurotensin receptor in cancer[J].Anticancer Res,2000,20: 53-58.[7]SWIFT S L,BURNS J E,MAITLAND N J.Altered expression of neurotensin receptors is associated with the differentiation state of prostate cancer[J].Cancer Research,2010,70(1): 347-56.

[8]SEHGAL I,POWERS S,HUNTLEY B,et al.Neurotensin is an autocrine trophic factor stimulated by androgen withdrawal in human prostate cancer[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1994,91(11): 4673-4677.

[9]TAYLOR R M,SEVERNS V,BROWN D C,et al.Prostate cancer targeting motifs: expression of ανβ3,neurotensin receptor 1,prostate specif i c membrane antigen,and prostate stem cell antigen in human prostate cancer cell lines and xenografts[J].Prostate,2012,72(5): 523-532.

[10]AMORINO G P,DEEBLE P D,PARSONS S J.Neurotensin stimulates mitogenesis of prostate cancer cells through a novel c-Src/Stat 5b pathway[J].Nature Publishing Group,2007,26: 745-756.

[11] SUTHERLAND M,GORDON A,SHNYDER S D,et al.RGD-binding integrins in prostate cancer: expression patterns and therapeutic prospects against bone metastasis[J].Cancers (Basel),2012,4(4): 1106-1145.