甲基莲心碱在氧化应激中的作用机制研究

刘向东，李慧，王成志，赵焕东，肖平

（1.中南大学湘雅医院 肾内科，湖南 长沙 410008；2.湖南省长沙市第一医院 呼吸科，湖南 长沙 410005；3.中南大学湘雅医院 卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南 长沙 410007）

甲基莲心碱（Neferine, Nef）是从莲子心中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱[1-2]。研究表明，其具有抗癌﹑抗血栓形成﹑减轻急性肾损伤﹑抑制炎症和氧化应激等生物学作用[1-7]。但对于Nef在糖尿病肾病中的作用及机制尚不清楚。本研究以高糖培养大鼠近端肾小管上皮细胞（normal rat kidney proximal tubular epithelial cell, NRK-52E）复制糖尿病体外细胞实验模型[8-9]。采用Nef进行干预，观察细胞活力﹑血红素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）和氧化应激指标的变化，探究Nef在糖尿病肾病中的作用及其机制。见图 1﹑2。

图1 Nef化学结构式

图2 NRK-52E细胞 （×100）

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

NRK-52E细胞株（中国科学院上海细胞库），DMEM细胞培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（中国杭州四季青生物工程材料有限公司），Nef（中国大连美仑生物技术有限公司），D-无水葡萄糖（中国北京索莱宝科技有限公司），锌原卟啉Ⅸ（zinc protoporphyrin Ⅸ, ZnP）和甘露醇购自美国Sigma公司，HO-1抗体和P67抗体购自美国Abcam公司，β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司），CCK-8（日本同仁化学研究所），总胆红素（total bilirubin,TB）﹑活性氧（reactive oxygen species, ROS）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所。细胞培养箱（日本SANYO公司），酶标仪（美国Bio-Tek公司），电泳仪（美国BIORAD公司），Fluor Chem R多功能成像分析系统（美国ProteinSimple公司），流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将NRK-52E细胞培养于含5%胎牛血清的DMEM低糖培养基，于37℃﹑5%二氧化碳CO2细胞培养箱中培养，每1﹑2天更换培养基。细胞长满瓶底约80%时，按1∶3～1∶5进行传代，取对数期细胞用于实验。

1.2.2 细胞分组 实验分为6组：①对照组，用正常葡萄糖浓度（5.5 mmol/L）的DMEM培养基培养细胞，不予特殊处理；②高渗组，在对照组中加入38.9 mmol/L甘露醇，作为渗透压对照[8]；③高糖组，加入无水葡萄糖使DMEM培养基中葡萄糖浓度达44.4 mmol/L，作为糖尿病肾病体外细胞实验模型[8-9]；④Nef组，在高糖组中加入2μmol/L Nef；⑤HO-1抑制剂组，在Nef组中加入10μmol/L HO-1特异性酶活性抑制剂ZnP；⑥ZnP组：对照组中加入10μmol/L ZnP。上述各组干预时间均为24 h。

1.2.3 CCK-8法 采用CCK-8法检测细胞活力。取对数期NRK-52E细胞种植于96孔板，细胞密度2 000个/孔，培养12 h后进行换液，加入含不同处理组药物的培基继续培养24 h，再加入10μl CCK-8试剂于37℃细胞培养箱中孵育2 h，最后使用酶标仪检测各孔450 nm处吸光度。上述实验独立重复≥3次。

1.2.4 Western blot检测 采用 Western blot检测HO-1和P67的表达。使用RIPA细胞裂解液裂解各组细胞，收集蛋白样品。使用10% SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离，再将蛋白质电转移（250 mA，2 h）至0.45μm孔径的PVDF膜；用含5%胎牛血清白蛋白的TBST封闭2 h；随后于4℃孵育一抗过夜（HO-1比例1∶20 000，P67和β-actin比例1∶2 000）。用TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗于室温孵育1 h；TBST洗膜洗膜3次，10min/次，最后使用超敏ECL化学发光剂显影，用Alpha-View软件进行灰度值分析。

1.2.5 DCFH-DA探针 采用DCFH-DA探针检测ROS。取对数期细胞接种于6孔板，培养稳定12 h后换液，加入含不同处理组药物的培基继续培养21 h，再加入8μmol/L DCFH于37℃孵育3 h，弃培养液，预冷PBS漂洗2遍，加入无EDTA的胰酶消化后收集细胞，预冷PBS再次漂洗2遍，加入PBS重悬（细胞密度10×106个/ml），最后使用流式细胞仪检测细胞内荧光信号（激发波长500 nm，发射波长525 nm），采用Flowjo 7.6软件进行结果分析[10-12]。实验独立重复3次。

1.2.6 TB和MDA的检测 细胞接种于培养皿，培养稳定12 h后换液，加入含不同处理组药物的培基继续培养24 h，收集细胞，按照检测试剂盒说明书分别定量检测TB和MDA，并使用细胞总蛋白进行标准化（nmol/mg）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nef对高糖培养的NRK-52E细胞活力的影响

对照组﹑ZnP组﹑高渗组﹑高糖组﹑Nef组﹑HO-1抑制剂组的细胞活力分别为（100.00±8.33）%﹑（84.18±6.64）%﹑（91.30±10.62）%﹑（73.88±7.82）%﹑（108.16±12.12）%和（84.26±11.57）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.837，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，ZnP组﹑高渗组的细胞活力与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高糖组细胞活力低于对照组和Nef组（P＜0.05）；HO-1抑制剂组细胞活力低于Nef组（P＜0.05）。

对照组NRK-52E细胞活力为（100.00±10.71）%，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0﹑4.0﹑6.0﹑8.0 和 16.0μmol/L Nef组 的 细 胞 活 力 分 别 为（76.67±9.99）%﹑（81.11±7.68）%﹑（90.11±7.41）%﹑（103.81±15.81）%﹑（114.08±10.19）%﹑（116.21±5.59）%﹑（94.30±7.11）%和（53.16±7.29）%，经方差分析,差异有统计学意义（F=17.333，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，0.0μmol/L Nef组细胞活力低于对照组（P＜0.05）；16.0μmol/L组细胞活力低于 0.0μmol/L Nef组（P＜0.05）；2.0﹑4.0﹑6.0和 8.0μmol/L Nef组细胞活力均高于0.0μmol/L Nef组。见图3。

2.2 Nef对HO-1和P67蛋白表达的影响

2.2.1 HO-1蛋白 对照组HO-1蛋白相对表达量为（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef组HO-1蛋白相对表达量分别为（1.34±0.10）﹑（1.58±0.30）﹑（2.22±0.47）﹑（2.96±0.39）和（3.62±0.19），经方差分析，差异有统计学意义（F=36.778，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，0.0μmol/L Nef组HO-1蛋白相对表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef组HO-1蛋白表达水平高于 0.0μmol/L Nef组（P＜0.05）。见图4。

图3 不同浓度Nef对NRK-52E细胞活力的影响 （±s）

图4 不同浓度Nef对HO-1和P67蛋白表达的影响

2.2.2 P67蛋白 对照组P67蛋白相对表达量为（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef组P67蛋白相对表达量分别为（2.02±0.21）﹑（1.70±0.13）﹑（1.56±0.08）﹑（1.31±0.09） 和（1.16±0.15），经方差分析，差异有统计学意义（F=25.728，P=0.000）（见图4）。进一步两两比较经LSD-t检验，0.0μmol/L Nef组P67蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）；0.5﹑1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef组P67蛋白表达水平低于0.0μmol/L Nef组（P＜0.05）。对照组﹑高渗组﹑高糖组﹑Nef组﹑HO-1抑制剂组﹑ZnP组的P67蛋白相对表达量分别为（1.00±0.00）﹑（1.08±0.17）﹑（1.75±0.15）﹑（1.32±0.22）﹑（1.98±0.13）和（1.19±0.03），经方差分析，差异有统计学意义（F=23.629，P=0.000）（见图 5）。进一步两两比较经LSD-t检验，高糖组P67蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）；Nef组P67蛋白表达水平低于高糖组（P＜0.05）；HO-1抑制剂组P67蛋白表达水平高于 Nef组（P＜0.05）。

2.3 Nef对HO-1酶活性的影响

对照组﹑ZnP组﹑高渗组﹑高糖组﹑Nef组﹑HO-1抑制剂组的HO-1酶活性分别为（0.75±0.13）﹑（0.57±0.10）﹑（0.87±0.17）﹑（1.07±0.11）﹑（2.90±0.29）和（0.66±0.12）nmol/mg，经方差分析，差异有统计学意义（F=86.536，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，高糖组HO-1酶活性高于对照组（P＜0.05）；Nef组HO-1酶活性高于高糖组（P＜0.05）；HO-1抑制剂组HO-1酶活性低于Nef组（P＜0.05）。

对照组HO-1酶活性（0.75±0.13）nmol/mg，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef组 的 HO-1酶 活 性分 别 为（1.07±0.11）﹑（1.46±0.20）﹑（2.03±0.24）﹑（2.90±0.29）和（3.52±0.35）nmol/mg，经方差分析，差异有统计学意义（F=63.828，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，0.0μmol/L Nef组HO-1酶活性与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef组的HO-1酶活性高于0.0μmol/L Nef组（P＜0.05）。见图 6。

2.4 Nef对高糖培养的NRK-52E细胞ROS水平的影响

对照组﹑高渗组﹑高糖组﹑Nef组﹑HO-1抑制剂组﹑ZnP组的ROS分别为（1539.16±882.07）﹑（2564.16±1550.08）﹑（13342.50±1952.24）﹑（5077.83±611.45）﹑（16175.83±678.36）和（2248.16±1592.09），经方差分析，差异有统计学意义（F=69.496，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，高糖组ROS水平高于对照组（P＜0.05）；Nef组ROS水平低于高糖组（P＜0.05）；HO-1抑制剂组ROS水平高于Nef组（P＜0.05）。见图 7。

2.5 Nef对MDA的影响

对照组﹑ZnP组﹑高渗组﹑高糖组﹑Nef组﹑HO-1抑 制 剂 组 的 MDA分 别 为（0.381±0.036）﹑（0.536±0.031）﹑（0.492±0.039）﹑（0.914±0.093）﹑（0.472±0.070） 和（1.038±0.088）nmol/mg， 经 方差分析，差异有统计学意义（F=52.016，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，高糖组MDA水平高于对照组（P＜0.05）；Nef组MDA水平低于高糖组（P＜0.05）；HO-1抑制剂组MDA水平高于Nef组（P＜0.05）。

图5 不同处理组P67蛋白表达水平比较

图6 不同浓度Nef对 HO-1酶活性的影响 （±s）

图7 不同处理组ROS的变化

3 讨论

氧化应激在组织器官损伤和功能障碍中扮演重要角色[13]。过高的ROS可使细胞内蛋白质﹑脂质和核酸出现过氧化损伤，并引起细胞代谢障碍，最终导致细胞功能障碍，甚至出现坏死或凋亡[13-16]。在糖尿病中，NADPH氧化酶活性增加﹑线粒体功能障碍等导致ROS产生增多，而超氧化物歧化酶﹑过氧化氢酶﹑谷胱甘肽过氧化物酶功能下降又引起ROS清除障碍，最终导致ROS产生并积聚，使机体持续处于氧化应激状态[14-15,17]。在糖尿病肾脏，ROS可直接损伤滤过屏障﹑足细胞﹑内皮细胞和肾小管上皮细胞，还可通过激活多元醇途径和蛋白激酶C，促进糖基化产物形成及肾间质纤维化，最终导致糖尿病肾病[8，14，18]。目前临床上常使用硫辛酸﹑维生素E等抗氧化剂进行抗氧化应激治疗，但疗效有限，因此寻找更安全有效的抗氧化应激药物是当务之急[19]。

已知中药莲子心具有解热﹑镇痛﹑止血剂等功效。Nef是莲子心的重要活性成分。以往研究表明，其具有抗癌﹑抗心律失常﹑抗血栓形成﹑抗纤维化﹑抗炎﹑抗氧化应激及抗凋亡等作用[1，6，20-21]。本研究利用高糖培养NRK-52E细胞，复制糖尿病肾病体外实验模型[8]，通过检测NADPH氧化酶﹑ROS﹑MDA及细胞活力，证实高糖可以诱导NRK-52E细胞出现氧化应激，导致细胞活力下降，并发现Nef可减轻上述氧化应激损伤。

NADPH氧化酶是产生ROS的主要酶，与肾脏氧化应激密切相关，由5个亚基组成：2个膜亚基gp91﹑p22组成膜复合体，3个胞质亚基p40﹑p47﹑p67[8]。本研究通过Western blot检测P67亚基，反映NADPH氧化酶的表达和氧化应激。HO-1是血红素代谢的关键酶，广泛表达于全身各个组织器官，可将血红素分解为一氧化碳CO﹑胆绿素和Fe2+，具有舒张血管﹑抗炎﹑抗氧化应激及抗凋亡等作用[22-23]。在肾脏，HO-1主要表达于近端肾小管上皮细胞，依次是远端小管﹑集合管和髓袢，肾小球﹑足细胞和系膜细胞几乎不表达，因此本实验选择NRK-52E细胞作为研究对象[24-25]。HO-1是一种蛋白酶，其抗氧化应激功能主要由其代谢产物胆红素和CO产生，因此在实验中常采用胆红素的浓度来反映HO-1的酶活性[22，26]。HO-1抗氧化应激作用的强弱除与量有关，更与酶活性相关。本实验使用的ZnP就是与HO-1酶活性中心特异性结合，从而抑制HO-1的功能，但其对HO-1的表达无抑制作用，甚至因为酶活性下降，导致底物堆积，反而促进HO-1的表达[27-28]。本研究通过检测HO-1的表达和酶活性，并比较其在高糖组﹑Nef组和HO-1抑制剂组的变化，且同时检测和比较该组P67的表达水平﹑细胞活力﹑ROS和MDA，结果发现Nef可以诱导HO-1的表达并增加酶活性，相应地使P67表达下调，ROS和MDA下降，细胞活力增加；当抑制HO-1活性后，Nef上述作用消失，由此说明Nef具有抗氧化应激作用，而且该作用是通过HO-1实现的。

综上所述，本研究发现Nef通过诱导HO-1表达并增加酶活性，从而抑制NADPH氧化酶的表达，导致ROS减少，脂质过氧化减弱，氧化应激损伤减轻，从而保护细胞。不仅证实高糖可诱导氧化应激损伤，Nef具有抗氧化应激作用，并探究Nef抗氧化应激的部分机制，为临床治疗糖尿病肾病和氧化应激损伤提供新思路和实验依据，也为Nef的后续实验和临床应用打下实验基础。但本研究尚局限于细胞水平，且氧化应激检测指标有限，也只探究了Nef抗氧化应激作用与HO-1的关系，尚需从整体水平进一步验证，并探究更多的Nef抗氧化应激机制。

参 考 文 献：

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