免疫胶体金技术检测猪繁殖与呼吸综合征

徐丽华，李军星，苏 菲，田瑞雨，王 赛，袁秀芳(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)最早于1987年在美国发现，随后在短短几年内迅速遍及全球各个养猪业发达的国家和地区[1-2]。1996年，我国首次在北京分离到PRRSV，随后在我国猪群中感染率逐年上升，某些地区猪群血清阳性率已达50%～80%。PRRSV主要引起母猪的繁殖障碍与新生仔猪的呼吸道疾病，以及免疫抑制和持续性感染，造成仔猪的高死亡率，给养猪业造成了巨大的经济损失[3-5]，猪繁殖与呼吸综合征是目前危害我国养猪业的最主要传染病之一。

猪场中猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的诊断检测，一般根据其流行病学、临床症状以及剖检情况进行初步诊断，再应用实验室方法进行确诊。目前PRRSV的检测方法主要有反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和电镜观察等[6]。这些检测方法都存在检测成本高、需要一定的仪器设备、需要具备相关实验技能的技术员进行操作等缺点，不适于基层临床使用[6]。

胶体金免疫技术是80年代继荧光素、放射性同位素和酶3大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术[7]。该方法最初仅用于免疫电镜技术，现在已发展到免疫印迹、免疫斑点渗滤法及免疫层析法等方法，并广泛应用于临床诊断中。胶体金免疫技术具有简单快速、单份测定、特异敏感，且不需要任何仪器设备，在几分钟内就可观察到颜色对比鲜明的实验结果等特点，具有很大的发展潜力和应用前景[8-9]。

本实验综合应用分子生物学技术、生物化学技术和免疫学技术，探索建立斑点胶体金免疫检测技术，试图为临床提供一种简便、快速、灵敏、特异的检测PRRSV手段。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

标准阴、阳性血清采自临床健康断奶仔猪，经美国IDEXX公司生产的ELISA检测试剂盒鉴定；冻干酶联葡萄球菌A蛋白购自上海科欣生物科技研究所；牛血清白蛋白购自上海华美生物工程公司；弗氏佐剂为Sigma公司产品；氯化金、柠檬酸三钠、碳酸钾、辛酸、硫酸铵等化学试剂均为国产分析纯；0.45 μm硝酸纤维素薄膜为浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品。

1.2 工具酶和菌种

限制性内切酶BamH I、XhoI、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶购自上海生工生物工程公司；100 bp DNA Marker、低分子量标准蛋白Marker、凝胶回收试剂盒(Lot0307)购于上海申能博彩生物科技有限公司。原核表达载体pET-28 a(+)由浙江大学动物科学学院余旭平副教授惠赠。受体菌E.coliDH5α和E.coliBL21-plysS由本实验室保存。

1.3 兔抗猪IgG多克隆抗体的制备及纯化

采集临床健康猪血清，辛酸-硫酸铵法提取猪IgG[10-11]，以SDS-PAGE电泳检测猪IgG的纯度，Lowry法测定蛋白浓度。与弗氏完全佐剂或不完全佐剂等量混合制成乳液，4 ℃保存备用。

从浙江省农科院畜牧兽医研究所种兔场选取1.5～2 kg体重的新西兰兔2只，首次用含弗氏完全佐剂的猪IgG乳液进行足垫免疫，每只兔注射0.4 mL。隔14 d后，用含弗氏不完全佐剂的猪IgG乳液进行第2次免疫；14 d后进行第3次免疫；再隔10 d，对实验兔进行耳静脉采血。琼脂扩散试验测定效价，达到预期效价后，进行心脏采血，分离血清，再应用辛酸-硫酸铵法初步纯化兔抗猪IgG，测定多抗的蛋白浓度。

1.4 原核表达载体的构建和表达

采集临床疑似PRRS的组织病料，提取病毒基因组RNA，用RT-PCR技术扩增出特异性条带，经测序分析后确定为PRRSV核衣壳蛋白的全基因序列，命名为PRRSV/N。将PRRSV/N片段和原核表达载体pET-28 a(+)进行连接，并转入受体菌E.coliBL21-pLysS中，取得单菌落，提取质粒DNA，经双酶切鉴定后，将阳性克隆转化子接种于LB液体培养基(含50 U·mL-1卡那霉素)，IPTG诱导表达4 h，收集菌体，经15% SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。Western blot验证表达产物的免疫反应性。

1.5 表达蛋白的纯化

表达蛋白的纯化按照《分子克隆实验指南》(第二版)操作[12]。纯化蛋白经15% SDS-PAGE电泳后，将凝胶用3 mol·L-1KCl溶液显色，切下目的条带，重蒸水冲洗，放入电浓缩装置中进行电浓缩4～5 h。吸取浓缩液装入透析袋中，用0.02 mol·L-1Tris-HCl，0.9% NaCl溶液透析过夜，即得纯化蛋白。

1.6 胶体金的制备及标记

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[13-14]。先取100 mL双蒸水，加入1%氯金酸水溶液1 mL制成终浓度为0.1%溶液，用恒温磁力搅拌器加热搅拌，沸腾后立即加入2 mL新鲜配制的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热并剧烈搅拌，等溶液颜色稳定为酒红色，停止加热搅拌，用双蒸水补足到原体积，冷却至室温。用0.2 mol·L-1K2CO3调至pH值8.2，在磁力搅拌下加入0.8 mg提纯的兔抗猪IgG多克隆抗体，搅拌15 min后加入BSA至终浓度为0.5 g·L-1，继续搅拌10 min后取出。混合物先在4 ℃，4 000 r·min-1，离心10 min；取上清再用高速冷冻离心机，13 000 r·min-1，4 ℃离心30 min；弃上清，沉淀用0.02 mol·L-1Tris-HCl(pH值7.4)、0.2% BSA溶液洗涤1次，按原始体积的1/10将沉淀重悬于胶体金保存液(0.02 mol·L-1Tris-HCl，0.5% BSA)，4 ℃保存备用。制备的胶体金委托浙江大学科学楼电镜室作电镜检查。

1.7 斑点胶体金免疫检测技术的建立

剪取大小为0.5 cm×0.5 cm、孔径为0.45 μm的硝酸纤维素薄膜(NCM膜)，直接点样加上PRRSV/N纯化蛋白，室温干燥后，用1%脱脂奶粉封闭30 min，0.01 mol·L-1PBS(pH值7.2)洗涤3次，将NCM膜粘于0.5 cm×5 cm的塑料棒上成检测试剂条。用PRRSV标准阴性和阳性血清，1∶50稀释后与NCM膜作用30 min，0.01 mol·L-1PBS(pH值 7.2)洗涤3次，直接加入已标记好的胶体金悬液中，室温5 min，肉眼观察结果。同时进行Dot-ELISA法检测，验证结果的正确性。

2 结果与分析

2.1 兔抗猪IgG多克隆抗体的制备

实验兔经猪IgG三次免疫后，耳静脉采血，琼脂扩散试验测定，抗体效价已达1∶16(图1)。所有免疫兔心脏采血，分离血清，辛酸-硫酸铵法纯化兔抗猪IgG，经SDS-PAGE检测，主要呈现IgG分子的2个条带(图2)。Lowry法测定兔抗猪IgG蛋白浓度为14.6 mg·mL-1。

图1 琼脂扩散实验测定兔抗猪IgG抗体效价

M为低分子量标准蛋白Marker；1为兔抗猪血清；2为兔抗猪IgG抗体图2 SDS-PAGE电泳检测兔抗猪IgG抗体

2.2 PRRSV/N基因原核表达载体的构建

RT-PCR技术，从临床组织病料中扩增出PRRSV的核衣壳蛋白全基因序列，电泳检测扩增片段大小与预期相符(图3)。

M为100 bp DNA Ladder plus；1为PRRRSV A/N基因图3 PRRSV/N基因PCR扩增结果

将扩增的PRRSV/N片段和原核表达载体pET-28a(+)连接并转入BL21感受菌后，获得单菌落，经双酶切鉴定后(图4)，测序验证克隆正确。

M为pUC19 DNA/Mspl(Hpa11)+Lambda DNA/Hind111 Marker；1为PRRSV A/N双酶切结果图4 PRRSV/N双酶切产物

2.3 融合蛋白的表达及免疫印迹检测

正确克隆的转化子用IPTG诱导，表达产物经15% SDS-PAGE电泳和染色分析发现，重组PRRSV/N蛋白获得了高效表达，目标蛋白的分子量约为17 ku(图5)，与预期相符。

1为pET-PRRSV/N诱导前菌体蛋白；2为pET-PRRSV/N诱导后菌体蛋白；M为低分子量标准蛋白Marker图5 SDS-PAGE检测

表达产物转膜后，分别以PRRSV阴性和阳性血清进行Western blot分析。显色结果表明，表达蛋白可被PRRSV阳性血清所识别，马上出现清晰的条带；而与阴性血清作用，呈阴性反应(图6)。

1为阳性血清检测重组蛋白；2为阴性血清对照；M为低分子量标准蛋白Marker图6 重组蛋白的Western-Blot检测

2.4 融合蛋白的纯化

pET在大肠杆菌中表达出PRRSV/N后，表达蛋白以包涵体形式存在。将细菌裂解后收集包涵体，用8 mol·L-1尿素裂解，再经15% SDS-PAGE电泳检测，表达蛋白纯度在90%以上，蛋白浓度为20.6 mg·mL-1(图7)。将PRRSV/N初步纯化的蛋白再经过SDS-PAGE电泳，割取凝胶进行电浓缩，透析取得纯化蛋白。

1为PRRSV/N融合蛋白；2、3、4分别为PRRSV/N纯化蛋白倍比稀释；M为低分子量标准蛋白Marker图7 为PRRSV/N纯化蛋白倍比稀释SDS-PAGE检测

2.5 斑点胶体金免疫检测技术的建立

在100 mL氯金酸溶液中加入2 mL 1%柠檬酸三钠水溶液，烧制出的胶体金经电镜观察，直径在18～20 nm，跟文献报导相符合(图8)。

图8 电镜观察胶体金颗粒(10万倍)

选取PRRSV标准阴性和阳性血清，用标记好的胶体金作用，在5～10 min内就可以看到清晰的显色，且阴阳性对比明显(图9)。

图9 斑点胶体金检测PRRSV阴阳性血清结果

3 讨论

近年来，PRRSV在我国的不同省、市、自治区都存在不同程度的流行，其感染率高，造成的损失很大，给养猪户带来了极大的困扰。目前检测PRRSV主要应用美国IDEXX生产的ELISA检测试剂盒，但该方法检测不但价格较高(每头检测成本高达30～50元)，而且需要一定的设备和实验操作要求，另外整个检测过程需要2～3 h，临床上难以推广应用。因此，建立一种方便、快捷且准确的诊断方法，对及时预防该病具有重要意义。

胶体金免疫技术是以胶体金作为显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。具有简单、快速、准确和不需要任何实验仪器等优点，已广泛应用于临床医学，而在动物医学上应用还不多，具有很大的开发前景。

制备胶体金的方法很多，主要有柠檬酸三钠还原法、柠檬酸三钠-鞣酸还原法、白磷还原法等，其中柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒比较均匀一致。本实验采用柠檬酸三钠还原法，通过对不同用量的柠檬酸三钠与氯金酸反应，以及制备胶体金颗粒的最佳反应时间等的摸索，最后证明100 mL氯金酸溶液，用2 mL柠檬酸三钠还原最好，制备出的胶体金颗粒大小较均匀，直径在18～20 nm。另外，pH值对胶体金标记的影响也很大，根据文献报道，我们将二抗标记时pH值调至8.2，实验证明，最后反应效果较好。

斑点胶体金法检测抗原或抗体出现特异性反应，最重要是需要高纯度的纯化抗原。在PRRSV的结构蛋白中，核衣壳蛋白(N蛋白)是保守性蛋白，其免疫原性最强。本实验选取了N蛋白为研究对象，应用原核表达系统以融合蛋白的形式高效表达了该蛋白，并以包涵体的形式存在。用细菌裂解液裂解菌体，所得包涵体再用8 mol·L-1尿素裂解，经SDS-PAGE电泳检测得到初步纯化的蛋白浓度比较高，再经过电浓缩，蛋白复性液透析后得到高浓度的纯化蛋白。经过Western blot分析，表明该蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应，非特异性背景很低；而和PRRSV阴性血清作用后则无反应，说明纯化蛋白具有很高的反应特异性。另外，PRRSV/N蛋白的等电点为10.7，其中有1个二硫键，因此选用pH值为11的蛋白复性液进行透析，效果较好。将纯化蛋白点在NCM膜上，经PRRSV标准阴阳性血清作用后，直接浸于标记好的胶体金中，5～10 min就可以用肉眼直接观察结果，其中阳性血清作用后，NCM膜上出现清晰的鲜红色斑点，而阴性血清作用的NCM膜上无斑点出现。

本实验采用斑点胶体金法，除了用胶体金标记代替酶标记和酶底物外，其原理及操作与Dot-ELISA法基本相同，检测的灵敏度和特异性也相仿。因前者比后者减少底物显色步骤，同时色彩鲜明反差强，检测时间更短，30～40 min即可检测结果。此外，具有可肉眼直接观察结果、单份测定、操作简便、能在基层使用等优点。目前我们正进一步提高胶体金检测的灵敏度和稳定性，同时进行临床检测试验。

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