靶向LOX-1的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块近红外荧光成像及阿托伐他汀干预实验研究

卢瞳，安艳丽，居胜红，滕皋军

东南大学附属中大医院放射科，江苏省分子影像与功能影像重点实验室，东南大学医学院，江苏南京 210009；

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉壁的慢性炎症，AS所致急性心脑血管事件是世界范围内的主要死亡原因和致残原因[1]。既往研究显示，血管内皮功能障碍、巨噬细胞激活、平滑肌细胞迁移、胶原增生及血管新生等多个病理生理学过程参与AS的发生及进展[2]。近年来，易损性斑块成为研究热点，其不稳定，易发生破裂、出血或血栓形成，是引起急性心血管事件的主要原因[3]。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）是AS形成的重要始动因素之一，而oxLDL的作用主要由其特异性受体凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectinlike oxLDL receptor-1，LOX-1）介导[4]，其在AS斑块的发生、进展和失稳定过程中发挥重要作用[5]。本课题组前期研究结果显示，斑块易损性主要与斑块构成相关，而非斑块的大小或动脉狭窄程度，应用近红外荧光成像（near-infrared fluorescence imaging，NIRF）和MRI及相应分子靶向探针可无创评价AS易损斑块的特征[6-9]。本研究拟构建新型稳定的靶向 LOX-1荧光分子探针，特异性靶向易损斑块内巨噬细胞LOX-1受体，采用NIRF示踪ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块，并评价阿托伐他汀对易损斑块的干预效果，为探讨临床早期防治心血管并发症提供新视角和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料及仪器 NIR797异硫氰酸酯（美国Sigma公司），兔抗小鼠anti-LOX-1-mAb、非特异性IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。RAW264.7小鼠巨噬细胞（中国科学院上海生物科院细胞资源中心），阿托伐他汀（武汉远成共创科技有限公司）。多光谱活体近红外成像系统（美国Cri公司），冰冻切片机（德国Leica CM1950 Heidelberg），荧光正置显微镜（德国BX53，Olympus）。

1.1.2 实验动物 ApoE-/-小鼠，雄性，12周龄，购自北京大学医学部动物中心；正常C57BL/6小鼠作为对照。所有小鼠均喂养于无特定病原体动物级实验动物中心。本实验经东南大学医学院实验伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 构建anti-LOX-1-NIR797探针 取1 mg NIR797溶于200 μl二甲基亚砜（DMSO）溶液，将2 mg anti-LOX-1抗体溶于1 ml碱性磷酸盐溶液（PBS），缓慢加入NIR797-DMSO溶液，充分磁力搅拌并避光反应4 h。反应结束后，蒸馏水避光透析。探针置于4℃避光保存。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测探针免疫活性。非特异性IgG-NIR797探针制备同上。

1.2.2 体外细胞实验 小鼠源性巨噬细胞RAW264.7培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液，置于无菌细胞房培养箱（含5% CO2，温度为37℃）。选取生长良好的原代巨噬细胞培养至4～6代。LOX-1探针在以下 2种情况下与巨噬细胞共孵育：巨噬细胞用或不用oxLDL（60 μg/ml）预处理以制备激活或静止巨噬细胞，在37℃下共孵育8 h。行免疫荧光染色，细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染10 min；去掉上清，PBS充分漂洗各孔细胞板3次，洗去多余染色，置于多通道荧光显微镜下（德国BX53，Olympus）观察荧光表达情况。

1.2.3 AS模型建立 12周龄 ApoE-/-小鼠按高脂高糖饮食（质量分数20%动物油、20%蔗糖和1.25%胆固醇）喂养16周，构建AS动物模型。

1.2.4 实验分组 基线实验部分，14只ApoE-/-小鼠分为anti-LOX-1-NIR797探针组（5只）、竞争性抑制组（4只，注入探针前预先注射2 mg/kg anti-LOX-1-mAb）和PBS组（5只），经尾静脉注入1 mg/kg靶向探针，24 h后行NIRF；另5只C57小鼠作为对照，注入1 mg/kg探针。干预实验部分，10只ApoE-/-小鼠 28周龄时完全随机化分组分为对照组或干预组（阿托伐他汀每天1.0 mg/kg，干预6周）行干预实验。

1.2.5 NIRF 经小鼠尾静脉注入 1 mg/kg探针 24 h后，用质量分数2%～4%异氟烷-空气混合气体麻醉小鼠置于 CRi成像仪中，2%异氟烷-空气维持麻醉。NIRF激发波长790 nm，白光和NIRF图由系统自动获取（曝光时间500～4000 ms）。NIRF后，经腹腔注射大剂量质量分数 10%水合氯醛麻醉处死小鼠，开胸、暴露胸腔与心脏，用PBS充分灌洗。于10倍体视显微镜下分离主动脉全段，并行离体NIRF。

1.2.6 NIRF数据分析 生成的 NIRF图像经系统自带的Maestro 2.20软件标准化背景信号，所有测量基于灰阶图像。3个大小相同的感兴趣区（ROI）从主动脉上人工勾画。血管信噪比（SNR）为已鉴定出的斑块区域3个ROI信号强度（signal intensity，SI）平均值与管腔外邻近区域背景噪声的比值。计算方法见公式（1）。

1.2.7 病理学分析 主动脉纵向切开行油红 O 染色及NIRF。将腹主动脉用最佳切片温度包埋剂（O.C.T.）包埋，冰冻切片机横断面连续切片（层厚7 μm）。行HE染色或免疫荧光染色。免疫荧光染色：藻红蛋白（PE）标记的Mac-3检测斑块内巨噬细胞分布，异硫氰酸荧光素标记的 anti-oxLDL抗体检测斑块内oxLDL分布，细胞核用DAPI复染。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件。符合正态分布的计量资料以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Tukey分析。油红O染色的斑块阳性面积以总斑块面积占整个血管面积的百分比表示，其与NIRF信号分布的关系采用线性相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分子探针的表征 构建好的anti-LOX-1-NIR797分子探针呈稳定、透明、可溶的浅绿色溶液（图1A）。NIRF显示探针的荧光信号强度较强（图1B），亦可观察到非特异性IgG-NIR797探针及单纯NIR797荧光染料的荧光信号，而阴性对照 PBS组未见荧光信号（图1C～E）。ELISA结果证实该靶向探针的免疫活性良好（图1F），构建的分子探针免疫活性与单纯anti-LOX-1单克隆抗体活性相符。

2.2 体外细胞实验 荧光显微镜显示巨噬细胞和oxLDL预先孵育过时anti-LOX-1-NIR797被巨噬细胞摄取最多；然而，非特异性IgG-NIR797或单纯NIR797组两种情况下巨噬细胞摄取均很少（图2）。

2.3 NIRF 经尾静脉注入 1 mg/kg anti-LOX-1-NIR797探针后，所有实验动物耐受良好。探针组ApoE-/-小鼠主动脉 NIRF示强荧光信号不均匀分布于主动脉斑块区（图3A），主要位于主动脉弓、主动脉分叉及腹主动脉（图3A）。竞争性anti-LOX-1-mAb可显著降低斑块SNR（F=33.5，P＜0.01，图3B）。而对照组 C57小鼠注入靶向探针或 ApoE-/-小鼠注入PBS时，其腹主动脉斑块SNR较弱，与靶向探针组比较，差异有统计学意义（F=33.5，P＜0.01，图3B）。

实验组ApoE-/-小鼠主动脉纵向切开后行油红O染色与NIRF，结果显示在靶向探针组油红O染色斑块面积和NIRF有相似的阳性分布，两者阳性面积呈正相关（r=0.917，P＜0.001，n=8）；脂肪染色斑块区与NIRF信号最强区并不完全一致，但两者相关（图4A）。在竞争性抑制组，部分油红O染色AS斑块区的NIRF信号缺失（图4B）。而在PBS组，典型AS区未见NIRF信号聚集（图4C）。

图1 分子探针的性状与表征。A为构建好的探针的直观彩图；B、C、D、E分别为anti-LOX-1-NIR797探针、非特异性IgGNIR797、对照组PBS、单纯NIR797染料的NIRF成像，显示靶向探针的荧光信号强度较强，而阴性对照 PBS组未见荧光信号；F为ELISA示anti-LOX-1-NIR797探针生物活性良好，而煮沸过的anti-LOX-1-NIR797或非特异性IgG-NIR797探针未见明显生物学活性

图2 RAW264.7巨噬细胞体外摄取anti-LOX-1-NIR797探针、非特异性IgG-NIR797和单纯NIR797的免疫荧光图。巨噬细胞与或不与氧化低密度脂蛋白（oxLDL）共孵育，再与 anti-LOX-1-NIR797一起孵育，免疫荧光检测探针被摄取情况。图中红色示NIR797荧光信号（箭），蓝色示细胞核。巨噬细胞和oxLDL预先孵育过时anti-LOX-1-NIR797被巨噬细胞摄取最多；非特异性IgG-NIR797或单纯NIR797组两种情况下巨噬细胞摄取均很少

图3 主动脉NIRF伪彩图。A、B为靶向探针组、竞争性抑制组、PBS组及对照C57组NIRF伪彩图及SNR比较。竞争性抑制组荧光信号SNR较靶向探针组降低，而PBS组及对照C57组NIRF信号较低。**P＜0.01，F=33.5

图4 主动脉纵向切开后油红O染色与NIRF结果。A、B、C分别示靶向探针组、竞争性抑制组及PBS组油红O染色及NIRF图，竞争性抑制组中，部分动脉粥样硬化斑块区其NIRF信号缺失（箭）

2.4 阿托伐他汀延缓腹主动脉 AS斑块进展 阿托伐他汀干预后，ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇和低密度脂蛋白水平降低，而高密度脂蛋白及三酰甘油未见明显影响。干预实验NIRF结果显示，阿托伐他汀干预组anti-LOX-1-NIR797荧光SNR较对照组明显降低（P＜0.05，图 5A～C），干预组腹主动脉平均斑块面积也减少（P＜0.05，图5A、B、D），而干预组斑块内oxLDL表达减少、脂质面积减少（图5A、B）。

图5 NIRF评价阿托伐他汀对斑块的干预效果。A、B分别示对照组、阿托伐他汀干预组主动脉NIRF伪彩图、油红O染色、NIRF及免疫荧光图；C示阿托伐他汀干预组斑块SNR较对照组显著降低（**P＜0.05，t=5.552）；D示干预组斑块面积较对照组减少（**P＜0.05，t=4.168）。箭示斑块内anti-LOX-1-NIR797荧光信号的表达，干预组荧光信号分布范围较对照组减少；*表示管腔

3 讨论

本实验构建新型靶向巨噬细胞 LOX-1受体的近红外探针在 NIRF平台可有效检测 ApoE-/-小鼠腹主动脉AS斑块。体外细胞实验证实活化的巨噬细胞特异性摄取anti-LOX-1-NIR797荧光探针。ApoE-/-小鼠主动脉斑块区检测到强近红外荧光信号，而腹主动脉油红O染色和NIRF显示AS斑块阳性面积呈线性相关。

急性心血管事件主要由AS易损斑块引起[3]。斑块失稳定主要取决于其构成，且失稳定过程复杂，涉及斑块构成改变、血管重塑等多个病理生理学过程[10]。本实验构建的动物模型AS易损斑块的特征包括：斑块脂质核心较大且为偏心性；纤维帽较薄，内见大量炎症细胞浸润；部分可见斑块底部较多新生血管或血管腔内出血。目前常用影像检查方法如动脉造影、B超、CT或常规MRI，可显示AS斑块形态学特征，但对监测其生物学特征及稳定性有限，因此发展能定性斑块构成的分子影像学技术十分重要[11]。NIRF无创、无电离辐射，光学探针具有高特异性及灵敏度，可长期动态监测特异性标记基因及蛋白的变化。有报道近红外染料吲哚菁绿（ICG）及光学相干断层成像（optical coherence tomography，OCT）转化用于临床[12-13]。而应用多模态成像综合评价易损斑块的发展演变与干预转归更有价值并能提供更多AS生物学特征信息，NIRF及分子探针是多模态成像的重要组成部分。本实验构建靶向LOX-1的NIRF探针，良好地示踪 ApoE-/-小鼠主动脉 AS斑块并有效评价阿托伐他汀对斑块的早期干预效果。而构建稳定的、高效能的多模态分子探针探讨易损斑块的动态进展是本研究的后续研究方向。

oxLDL使血管内皮细胞受损，诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞，并刺激多种炎性因子产生，是导致 AS发生及发展的关键因素。而 LOX-1是介导巨噬细胞摄取 oxLDL的主要清道夫受体，引起血管内皮细胞功能障碍，与 oxLDL特异性结合可激活PKC/MAPK/NF-κB信号通路，上调多种炎症介质表达，促进斑块进展与失稳定[5]。因此，靶向斑块内巨噬细胞 LOX-1成像有助于鉴定不稳定斑块，并监测AS药物疗效。本课题组前期应用靶向LOX-1-USPIO探针行 MRI[6]，可活体检测 ApoE-/-小鼠颈动脉不稳定斑块，并为活体评估他汀类药物治疗效果提供实验依据，结果显示靶向oxLDL和LOX-1的MRI是易损斑块动态监测的良好手段，与Briley-Saebo等[14]研究结果类似。而本研究以AS斑块内巨噬细胞LOX-1为靶点，构建anti-LOX-1-NIR797近红外探针，靶向示踪富脂质 ApoE-/-小鼠腹主动脉 AS斑块，显示LOX-1为AS良好成像靶点。同时LOX-1也是AS临床与实验研究的潜在治疗靶点，应用靶向 LOX-1探针行NIRF可评价AS斑块治疗效果及转归，并可行系列成像研究评价新药治疗前后斑块结构演变及斑块内成分表达的变化情况，这些将是本课题组今后的研究方向。本研究结果表明，应用anti-LOX-1-NIR797探针可检测到阿托伐他汀干预6周后ApoE-/-小鼠腹主动脉AS斑块的NIRF信号减弱、斑块面积减少、斑块内脂质减少及 oxLDL表达降低等变化，与既往研究结果类似[12]。

本研究的局限性：①本研究主要显示离体主动脉NIRF并与免疫荧光、油红O染色及组织病理学结果对照，而荧光成像获取更准确的活体内部器官或组织的生物学信息有限（受限于穿透力、其他器官干扰等），更好的动态成像技术为荧光分子断层成像[15]或OCT。②构建的anti-LOX-1-NIR797近红外探针的生物安全性需行进一步研究。③构建稳定的、生物相容性良好的多模态靶向探针对研究AS斑块生物学信息更有价值，这也是本课题组后续研究方向。

本研究通过构建靶向巨噬细胞 LOX-1受体的近红外探针，应用 NIRF有效示踪 ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块并评价阿托伐他汀干预疗效，为临床早期防治AS相关心血管并发症及今后基于LOX-1的多模态成像提供了理论依据。

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