吡非尼酮抑制转化生长因子β1诱导的大鼠角膜基质细胞纤维化

吴共发 邱丽浈 黄绮亭 刘钰君 曾宇婷 陈俊杰

1中山大学孙逸仙纪念医院（广州510120）；广州市增城区人民医院&中山大学孙逸仙纪念医院增城院区 2病理科，3内三科，4眼科（广州511300）；5广西贺州光明眼科医院（广西贺州542800）

角膜的透明性直接决定光线能否良好通过眼球。角膜损伤后角膜基质容易过度纤维化甚至形成瘢痕而引起角膜盲。目前角膜盲是仅次于白内障的全球第二位致盲性眼病［1］。临床上对于角膜瘢痕的防治仍十分棘手。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是新型广谱抗炎抗纤维化药物，具有广泛抗纤维化作用，已应用于临床治疗肺部纤维化等疾病［2-3］。人体不同器官或部位的纤维增生性疾病具有相同的致病机制，角膜瘢痕形成属于眼表纤维增生性疾病范畴，所以认为PFD理论上具有防治角膜瘢痕的潜能。本课题组前期研究［4］发现PFD能明显抑制大鼠角膜基质细胞的增殖能力，其机制可能与下调TGF-β1蛋白表达密切相关，在减轻角膜创伤愈合过程中的纤维化具有潜在的运用前景。本研究继续进一步探讨PFD抗角膜纤维化作用及可能机制，以期为临床寻找安全有效的角膜瘢痕防治药物。

1 材料与方法

1.1 材料 PFD粉末购自美国Selleck公司；DMEM培养基和胎牛血清为Gibco产品；重组人TGF-β1细胞因子购自美国Sigma公司；胰蛋白酶消化液、Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒、全细胞蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；小鼠单克隆Vimentin抗体、小鼠单克隆CollagenⅠ抗体、小鼠单克隆CollagenⅢ抗体、小鼠单克隆Keratocan抗体、小鼠单克隆CD90抗体购自英国abcam公司；柠檬酸盐修复液、PBS粉剂、小鼠单克隆GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、免疫组化检测试剂盒、DAB显色剂购自中杉金桥公司。PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 实验细胞培养及鉴定 8～10周龄健康SPF级SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心，雌雄不限，体质量150～220 g。大鼠处死后摘取眼球，显微镊撕去角膜上皮层和内皮层，将角膜基质层剪成4～5小块，加入少量含10%FBS的DMEM培养液，置于37℃ 50 mL/L CO2条件的培养箱中孵育，24 h后进行补加培养液。原代细胞长满80%左右后胰酶消化进行传代培养。制作细胞爬片，应用免疫细胞化学法行Vimentin染色对细胞进行鉴定，操作按照说明书进行。所有实验取第3～5代细胞进行。

1.2.2 细胞处理 细胞贴壁后换无血清DMEM作用24 h，使细胞同步化，然后细胞分为3组处理：（1）对照组：细胞给予含10%FBS的DMEM培养基；（2）TGF-β1组：对照组基础上加入2 ng/mL TGF-β1；（3）PFD组：TGF-β1组基础上加入1 mg/mL PFD处理。每组设置6个复孔，所有实验组细胞处理48 h。

1.2.3 细胞增殖实验 取对数生长期细胞以0.2×104个/孔数量均匀接种在96孔板，每孔终体积100 μL，细胞分组处理 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8液，置细胞培养箱避光孵育2 h，酶联免疫检测仪于450 nm处测定每个孔的吸光度（OD值），计算6个复孔平均值。

1.2.4 Western blot 细胞分组处理48 h后，胰酶消化离心收集3组细胞，全细胞蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白质，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，操作均按照说明书进行。使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制电泳所需的SDS-PAGE凝胶，每条凝胶泳道等质量40 μg蛋白上样，将凝胶上的蛋白湿转至PVDF膜，PVDF印迹膜加相应一抗4℃过夜孵育（CollagenⅠ释度为1∶1 000、Collagen Ⅲ释度为1∶600、Keratocan释度为1∶500、CD90释度为1∶250，GAPDH稀释度为1∶1 000），辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG按1∶5 000稀释使用，按照ECL反应检测试剂盒说明书，将膜放在化学发光成像系统，采用ECL化学发光法进行图像显影，GAPDH为内参，显像图用Image J软件进行分析读取灰度值，相对蛋白表达量=灰度值目的蛋白/灰度值GAPDH。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，多组资料的比较进行方差齐性检验和单向因素方差分析，方差齐则多重比较采用LSD法检验，方差不齐则多重比较采用Dunnett T3法检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态与鉴定 原代培养的大鼠角膜基质细胞呈圆形或多角形，胞体有丝状突触伸出，呈树枝状或骨针样。细胞贴壁后体积变大，突触有所变短，排列紊乱。免疫细胞化学行Vimentin染色鉴定，显示大鼠角膜基质细胞阳性表达Vimentin，胞浆呈棕黄色（图1）。

图1 大鼠角膜基质细胞胞浆呈Vimentin阳性表达Fig.1 The cytoplasm of rat corneal stromal cells were positive for Vimentin

2.2 细胞增殖能力变化情况 CCK-8检测显示对照组、TGF-β1组和PFD组OD值分别（0.855±0.565）、（1.531 ± 0.833）和（0.421 ± 0.384），差异具有统计学意义（F=484.68，P=0.000）。多重比较显示TGF-β1组OD值均高于对照组和PFD组（P=0.000）；相比对照组和TGF-β1组，PFD组OD值最低（P=0.000）。

2.3 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Keratocan和CD90蛋白的表达情况 以GAPDH为内参，PFD组的CollagenⅠ和Keratocan蛋白表达量明显高于对照组和TGF-β1组，两个蛋白均以TGF-β1组表达最低；PFD组的CollagenⅢ和CD90蛋白表达量明显低于对照组和TGF-β1组，两个蛋白均以TGF-β1组表达最高（图2）。统计分析各蛋白条带图的灰度值计算蛋白相对表达量，发现3组间的4个蛋白相对表达量差异均有统计学意义，其中CollagenⅠ和Keratocan蛋白表达量以PFD组最高，TGF-β1组最低（P＜0.05），CollagenⅢ和CD90蛋白表达量以PFD组最低，TGF-β1组最高（P＜0.05，表1）。

图2 各组CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白表达变化情况Fig.2 The expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein in each group

表1 各组CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白相对表达量比较Tab.1 The relative quantitative expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein were compared amog the groups ±s

表1 各组CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白相对表达量比较Tab.1 The relative quantitative expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein were compared amog the groups ±s

组别对照组TGF-β1组PFD组F值P值CollagenⅠ0.184±0.304 0.066±0.011 0.571±0.045 206.327 0.000 CollagenⅢ0.681±0.039 0.856±0.046 0.347±0.048 101.706 0.000 Keratocan 0.042±0.005 0.003±0.001 0.163±0.014 285.816 0.000 CD90 0.265±0.068 0.570±0.043 0.094±0.010 80.715 0.000

2.4 CollagenⅢ和CollagenⅠ比值 根据CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相对表达量，计算CollagenⅢ/CollagenⅠ比值，对照组、TGF-β1组和PFD组的CollagenⅢ/CollagenⅠ比值分别为3.757±0.609、13.192±2.233和0.612±0.104，以TGF-β1组的比值最高，PFD组比值最低（F=71.856，P=0.000）。

3 讨论

角膜损伤深达Bowman膜以下时，初期由角膜上皮细胞向下修复，后期由角膜基质细胞分泌胶原或成纤维细胞填充，愈合后往往形成瘢痕导致角膜混浊［5］。TGF-β被证实是角膜创伤修复最重要的细胞因子，也是导致角膜纤维化的主要调控细胞因子［6］，在TGF-β的亚型中以TGF-β1的调控作用最显著。过度TGF-β1具有延迟角膜上皮细胞再生、促进角膜基质细胞增生、激活静止的基质细胞向成纤维细胞及肌成纤维细胞转分化的作用，导致细胞外基质异常增多及沉积等多种生物学效应［7］。PFD的抗纤维化机制之一就是抑制TGF-β的过度表达。目前PFD在角膜瘢痕方面的研究报道不多。国外CHOWDHURY等［8］和FINK等［9］报道PFD能通过抑制TGF-β来减轻角膜化学性烧伤导致的角膜基质纤维化，抑制角膜瘢痕形成，但目前PFD抑制角膜纤维化的分子机制尚未阐明。

本课题组前期研究［4］发现PFD具有减轻角膜纤维化的潜能。已知TGF-β1能刺激角膜基质细胞出现纤维化表型［10］，据此本研究在大鼠角膜基质细胞中加入TGF-β1，观察PFD对TGF-β1的拮抗作用，以探讨PFD抗角膜瘢痕的可能机制及作用。结果显示TGF-β1能促角膜基质细胞增殖，而PFD能抑制这种促细胞增殖作用。TGF-β能促进成纤维细胞活化增殖，从而发挥致纤维化作用，是公认的最强有力的促纤维化细胞因子之一［11］。研究证实PFD治疗肺纤维化疾病的主要机制就是通过抑制TGF-β途径实现的［12］。结合本研究中PFD能拮抗TGF-β1对角膜基质细胞的活化增殖作用，笔者推测PFD是抑制角膜纤维化的较有效潜在药物。

正常角膜基质中CollagenⅢ极少，CollagenⅠ占80%以上，故CollagenⅢ/CollagenⅠ比值很小，角膜瘢痕形成时会产生过多的CollagenⅢ，此时细胞外基质以CollagenⅢ为主［13］，导致CollagenⅢ/CollagenⅠ比值增大，是病理性纤维化形成的标志之一。本研究进一步检测发现PFD能增强大鼠角膜基质细胞的CollagenⅠ表达而减弱CollagenⅢ表达，CollagenⅢ/CollagenⅠ比值以PFD组最低，TGF-β1组最高，证实TGF-β1能诱导角膜基质细胞纤维化的出现，而PFD能逆转TGF-β1诱导的角膜基质细胞纤维化。Keratocan被视为角膜基质细胞的标记物［14］，在基质细胞转化为成纤维细胞中表达明显减低［15］。CD90被证实在角膜基质成纤维细胞中高表达，在基质细胞纤维化过程中表达增加［16］，正常角膜基质细胞中基本不表达［17］，可以作为区分角膜基质细胞和基质成纤维细胞的可靠标记。本研究中PFD能增强角膜基质细胞的Keratocan表达和减弱CD90表达，提示PFD抑制TGF-β1诱导的纤维化，维持了正常角膜基质细胞表型。

综上所述，TGF-β1能刺激角膜基质细胞出现纤维化表型，而PFD能抑制TGF-β1诱导的角膜基质细胞纤维化表型，表现为细胞增殖受到抑制，CollagenⅠ和Keratocan表达增强而CollagenⅢ和CD90减弱，CollagenⅢ/CollagenⅠ比值增大。TGF-β作为公认的最强有力的促纤维化细胞因子之一，笔者推测PFD抗角膜基质细胞纤维化是通过抑制TGF-β分子途径，从而影响胶原合成和Keratocan、CD90蛋白表达实现的。本研究在前期基础上进一步验证了PFD能抑制TGF-β1诱导的大鼠角膜基质细胞纤维化的能力，有望成为治疗角膜纤维化及瘢痕的新手段。由于纤维增殖性疾病发生机制还涉及除TGF-β以外的其他多种致炎致纤维化因子，所以PFD抑制角膜纤维化的作用及机制尚待深入研究。

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