创伤弧菌快速检测法的建立

徐 宸，王 鑫，钟 江

(1.复旦大学生命科学学院，上海 200433；2.默克化工技术(上海)有限公司，上海 201203)

创伤弧菌(Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性杆菌，是广泛存在于海洋和盐湖中的嗜盐病原菌。它是一种重要的水产品污染病原，可造成养殖水产品的病害。同时也是一种致命的人类机会致病菌，与全世界大部分食用污染海鲜致死的案例有关[1]。创伤弧菌感染最致命的后果是原发性败血症，其死亡率在免疫功能低下的人群中可达50%以上[2]。由于创伤弧菌感染的高死亡率，创伤弧菌污染严重地区海鲜食品(尤其是生蚝)的安全问题是常见的。创伤弧菌的感染不仅给水产养殖业带来经济损失，而且也对人类健康造成危害。我国水产品品种丰富多样，每年因食用水产品而引起食物中毒、急性胃肠炎或腹泻等疾病屡有报道。因此，建立创伤弧菌的快速检测方法显得尤为非常重要。

传统的创伤弧菌的检测方法基于生理生化鉴定，由于弧菌属主要病原表型相似性较高，给鉴别工作带来较大困难，且鉴定过程费力耗时，不利于病原的确定和采取应对措施。 PCR和实时定量PCR(qPCR)技术被用来检测创伤弧菌[3-4]。然而，使用PCR和定量PCR需要昂贵的热循环仪，阻碍了这种方法的广泛应用。灵敏度更高的环介导等温PCR技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)也被用于检测创伤弧菌，但该方法在现场操作过程中受环境影响较大，容易造成假阳性[5]。几种免疫分析方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫层析试纸条也被应用于创伤弧菌的鉴定，检测试纸的灵敏度可达2×106CFU/mL。Li等[6]报道了采用改良斑点杂交技术检测哈维氏弧菌，灵敏度可达2×105CFU/mL，且整个操作时间由8 h缩短至2 h。笔者探索了将此改良方法用于创伤弧菌的检测，以期为创伤弧菌快速准确检测方法的建立提供参考。

1.2材料

1.2.1菌株及试验动物。创伤弧菌标准株ATCC 27562、溶藻弧菌(V.alginolyticus)标准株ATCC17749购自美国菌种保藏中心(ATCC)，阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)CMCC43501购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。创伤弧菌FD-1、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)由复旦大学生命科学学院A301-8实验室保存。Sp2/0-Ag14(Sp2/0)小鼠骨髓瘤细胞株由复旦大学生命科学学院A301-8实验室冻存。6～8周龄的雌性BALB/c小鼠购于上海杰思捷公司。

1.2.2试剂及仪器。化学发光试剂ECL和TMB底物购自上海纪宁实业有限公司。硝酸纤维素膜(NC膜)和聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)购自美国Millipore。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP和BSA购自北京索莱宝科技有限公司。封闭剂PBSTB为2%(W/V)BSA溶解在PBST溶液中；封闭剂PBSTM为5%脱脂奶粉充分溶解在PBST溶液中，以上2种溶液4 ℃保存备用。

1.3方法

1.3.1抗创伤弧菌单克隆抗体的制备。将创伤弧菌FD-1用TCBS培养基活化，标准株ATCC27562为对照，培养后2株均呈现黄色特征性菌落。通过16 s rDNA 测序后Blast比对FQ-1与创伤弧菌标准株ATCC27562的同源度达99%。将创伤弧菌FQ-1扩大培养，保存备用。测得菌液浓度约为1×1010CFU/mL，细菌用0.3%的甲醛灭活24 h，灭活后菌液经细菌检验平板不再长菌。灭活后的菌液于4 ℃保存备用。以灭活创伤弧菌菌体制备单克隆抗体，参照李强等[7]方法免疫BALB/c小鼠。筛选融合细胞采用新鲜培养的创伤弧菌FQ-1。经亚克隆化筛选后获得可稳定产生抗创伤弧菌抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞密度调至2×106个/mL，以每只0.5 mL的量注入8周龄BALB /c小鼠腹腔内，形成腹水后，以间接 ELISA 法检测腹水效价。采用Protein A亲和层析法对单克隆抗体进行纯化，以紫外光分光光度计测量纯化抗体浓度，将单抗溶液稀释50倍，分别于260 nm和280 nm 波长测吸光度，于-20 ℃保存备用。

1.3.2改良斑点杂交法。

1.3.2.1斑点杂交条件优化。根据文献[5]首先对封闭试剂、杂交膜以及封闭时间3个条件进行优化。将NC和 PVDF膜剪成边长为1 cm的正方形。将不同封闭剂PBSTB和PBSTM分别以每孔1 mL加入浸没膜块，于37 ℃培养箱中孵育10、20、40 min，依次取出并以PBST将膜彻底冲洗干净。将封闭后的膜块放入稀释度为1∶3 000的羊抗鼠二抗溶液中孵育90 min后取出并用PBST冲洗3次，最后用150 mL TMB显色液将膜浸润并孵育10 min。

1.3.2.2改良斑点杂交法特异性检测。分别将创伤弧菌FD-1、创伤弧菌(ATCC27562)、溶藻弧菌(ATCC17749)、哈维氏弧菌、副溶血弧菌置于TAB培养基(2.5%NaCl)于30 ℃过夜培养，将菌悬液稀释成1×108CFU/mL，以空白TAB培养基(2.5%NaCl)为对照；取5 mL 5种菌悬液加入膜中间并在60 ℃烘烤20 min使其固定在膜上；将膜取出放入含5%脱脂奶粉的封闭剂中，37 ℃封闭25 min；接着将封闭后的膜放入抗创伤弧菌单克隆抗体的稀释液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST将膜彻底冲洗干净后放入稀释度为1∶3 000的羊抗鼠二抗稀释液中，同样在37 ℃孵育90 min；最后将膜取出彻底洗尽残留二抗并用滤纸吸干残留的水分，将膜置于化学发光检测仪中，同时加入ECL显色液将膜浸润并在不同曝光时间下进行拍照。

1.3.2.3改良斑点杂交法灵敏度检测。将创伤弧菌悬液稀释成1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL共4种浓度，并以稀释液PBS作为空白对照。随后，分别取5 mL不同浓度的菌悬液点于膜中央并置于60 ℃烘烤20 min将其固定在膜上；将膜取出放入含5%脱脂奶粉的封闭剂中，37 ℃封闭25 min；接着将封闭后的膜放入抗创伤弧菌单克隆抗体的稀释液中，于37 ℃孵育60 min；用PBST将膜彻底冲洗干净后放入稀释度为1∶3 000的羊抗鼠二抗稀释液中，同样在37 ℃孵育90 min；最后将膜取出彻底洗尽残留二抗并用滤纸吸干残留的水分，将膜置于化学发光检测仪中，同时加入ECL显色液将膜浸润并在不同曝光时间下进行拍照。

2 结果与分析

2.1抗创伤弧菌单克隆抗体的制备以甲醛灭活的创伤弧菌作为抗原免疫小鼠后，以其他水体常见弧菌属和非弧菌属菌株作为检测抗原用于杂交瘤细胞的交叉反应试验。筛选到一株特异性分泌抗创伤弧菌抗体的杂交瘤细胞株3A8，对其产生单克隆亚型进行分型定量检测发现，IgG1亚型的丰度为66.5%，其余依次为Kappa亚型(22.3%)、 IgM亚型(2.7%)。因此，检测表明该抗体属于IgG1亚型，且效价在60 000以上，SDS-PAGE显示抗体分子量为55 kD(图1)，为斑点杂交法提供了原材料。

注：1为蛋白G结合后的上清样品；2为硫酸氨抽提的腹水样品；3、4为纯化的抗体样品；M为蛋白分子量标签Note:1.Supernatant flowing through protein G；2.Extracted solution of ascite by (NH4)2SO4；3，4.Purified antibody；M.Marker图1 创伤弧菌单克隆抗体纯化SDS-PAGE结果Fig.1 SDS-PAGE of the purified V. vulnificus antibody

2.2改良斑点杂交法灵敏度根据文献[6]采用Western blot化学发光试剂(ECL)代替TMB显色剂。由图2可知，改良ECL斑点杂交法对创伤弧菌的最低检测限为1×105CFU/mL，而间接ELISA最低检测限为1×107CFU/mL，与之前报道的检测结果一致[6]。与传统斑点杂交法及间接ELISA法相比，改良后的ECL介导的斑点杂交法具有更高的灵敏度，较传统的斑点杂交法的灵敏度高100倍；与间接ELISA法在单菌落(CFU)水平上相比，改良后的ECL介导的斑点杂交法灵敏度较其高1 000倍。

注：创伤弧菌菌液梯度稀释并固定至硝酸纤维素膜上(5 μL/孔)，以创伤弧菌单克隆抗体作为一抗，分别以化学发光试剂ECL和TMB作为显色剂。第1行为ECL显色剂：a～e.分别为1×109 ～1×105 CFU/mL 10倍梯度稀释创伤弧菌菌液；f为空白对照。第2行为TMB显色剂：a～f.分别为1×109 ～1×104 CFU/mL 10倍梯度稀释创伤弧菌菌液；g为空白对照。第3行：ELISA分别包被从，加入1∶4 000比例稀释的创伤弧菌单克隆抗体作为一抗，a～g.分别为1×108 ～1×102 CFU/mL 10倍梯度稀释创伤弧菌菌液(100 μL/孔)，h为空白对照 Note:Sensitivity of V. vulnificus serial dilutions were spotted onto the NCM (5 μL/spot) and conducted dot blot using MAb as the primary antibody. Chemiluminescent reagents ECL and TMB were used as colorants respectively.Row 1，ECL as a colorant:a.1×109 CFU/mL，b.1×108 CFU/mL，c.1×107 CFU/mL，d.1×106 CFU/mL，e.1×105 CFU/mL，f.blank. Row 2，TMB as a colorant:a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.blank. Row 3: The ELISA plate was coated with serial dilutions (from 1×108 to 1×102 CFU/mL，100 μL/spot) of V. harveyi，and 1∶4 000 dilutions of MAb was used as the primary antibody. a.1×108 CFU/mL，b.1×107 CFU/mL，c.1×106 CFU/mL，d.1×105 CFU/mL，e.1×104 CFU/mL，f.1×103 CFU/mL，g.1×102 CFU/mL， h.blank图2 几种创伤弧菌单克隆抗体检测法灵敏度比较Fig.2 Comparison of the sensitivity of the detection methods of monoclonal antibodies in V. vulnificus

2.3改良斑点杂交法特异性以创伤弧菌标准菌株ATCC 27562为阳性对照考察了该方法的特异性，并考察是否与水体常见细菌存在交叉反应，检测结果如图3所示，结果表明除与创伤弧菌FD-1株外，与哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌ATCC17749、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、阴沟肠杆菌CMCC43501均无交叉反应。当抗原包被浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105CFU/mL时，均可检出创伤弧菌，证明该方法可以用于创伤弧菌的检测。

3 讨论

创伤弧菌是广泛分布在世界沿海和河口的病原菌，可感染多种水生动物，导致养殖行业的重大经济损失。因此，对于创伤弧菌的检测显得尤为重要。目前已报道的创伤弧菌的检测方法主要有PCR检测、LAMP以及胶体金免疫层析试纸条法。PCR法虽然能够较快检测出创伤弧菌[8]，但需要特殊的设备和一定的技能，无法在基层养殖单位进行现场检测，而LAMP法虽然不需要特殊设备，但对操作环境要求较高，且易产生假阳性。胶体金免疫层析试纸条虽然操作简便，但灵敏度最高只能达1×105CFU/mL，无法用于病害的日常监测。

注：a～e.分别为细菌浓度为1×108 ～ 1×105 CFU/mL 10倍梯度稀释菌液固定的样品；f为空白对照Note：a～e.Bacterial concentration with 10-fold dilution: 1×108 ～ 1×105 CFU/mL；f. Blank图3 创伤弧菌改良斑点杂交法灵敏度检测Fig.3 Sensitivity detection of the modified speckle hybridization method of V. vulnificus

该研究基于传统斑点杂交技术，以灵敏性更好的ECL替代TMB底物显色液，实现了创伤弧菌高灵敏度检测，与之前报道的传统斑点杂交法相比灵敏度提高了100倍，比ELISA法提高了1 000倍，而且反应时间大幅度缩短，孵育时间从8 h缩短至2 h，可以用于创伤弧菌的现场快速检测。

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