大黄结合蒽醌提取条件的优化

李 景，刘喜纲，刘翠哲

(承德医学院，承德 067000)

大黄为一种常用中药，具有泻下攻积、清热泻火、逐瘀通经等功效，其生品临床上多用于治疗便秘。大黄中主要含蒽醌类化合物，分为结合蒽醌和游离蒽醌，其中结合蒽醌是大黄的主要致泻成分，由于结合蒽醌不能被上消化道的α-糖苷键酶水解，因糖的保护，也不易被上消化道吸收，当其进入大肠后被肠内β-糖苷键酶水解，释放出游离蒽醌，游离蒽醌刺激肠壁，进而产生泻下作用。另外，一小部分结合蒽醌经小肠吸收，经肝脏转化为游离蒽醌转运至大肠，刺激神经丛增加蠕动而致泻。大黄中的游离蒽醌绝大多数在上消化道被吸收或破坏，不能到达大肠。传统大黄煎剂常采用“生品后下”的方法[1，2]，就是为保证结合蒽醌的含量来发挥泻下药效。而2015版《中国药典》中，要求大黄中总蒽醌含量不少于1.5%，游离蒽醌不少于0.20%，尚未对起泻下作用的结合蒽醌制定质量标准，使得现今的大黄提取工艺研究主要以总蒽醌为指标[3，4]，结合蒽醌并未得到应有的重视，且近来国内外学术刊物较多地报道了大黄蒽醌类化合物的肾毒性和致癌性[5，6]，可能为蒽醌类成分吸收入血，在体内引起代谢异常，产生潜在毒性。对此，本试验以结合蒽醌转移率和游离型与结合型蒽醌比例为指标，提高结合蒽醌含量，同时控制游离蒽醌的含量，保证泻下药效，降低游离蒽醌在体内吸收入血可能引起的毒性，筛选出大黄结合蒽醌的最佳提取条件，为大黄制剂的发展提供理论支持。

1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，FW80型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，GT16-3型离心机(北京时代北利离心机有限公司)，AG254型分析天平(梅特勒-托利多)，KQ-300型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HSC-12A型氮气吹干仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。芦荟大黄素对照品(批号110795-201007，纯度：98.0%)、大黄酸对照品(批号110757-200206，纯度：99.4%)、大黄素对照品(批号110756-201512，纯度：98.7%)、大黄酚对照品(批号110796-201319，纯度：99.6%)、大黄素甲醚对照品(批号110758-201616，纯度：99.0%)均购自中国药品生物制品检定所。大黄药材购自安国市邦康中药材有限公司，由承德医学院中药研究所研究员赵春颖鉴定为蓼科植物药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根茎，甲醇(色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司)，95%乙醇、三氯甲烷均为分析纯。

2 方法与结果

2.1含量测定方法

2.1.1色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(70∶30)，柱温：30 ℃，流速：0.8 ml/min，检测波长：254 nm，进样量：10 μl。

2.1.2溶液的制备

2.1.2.1供试品溶液的制备 按照2015版《中国药典》中大黄蒽醌供试品溶液的制备方法[7]，将大黄药液过滤，取适量续滤液15 000 r/min离心10 min，进样测定游离蒽醌含量；精密量取续滤液1 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，离心进样，测定总蒽醌含量。结合蒽醌含量=总蒽醌含量-游离蒽醌含量；结合蒽醌转移率=药液中结合蒽醌含量/药材中结合蒽醌含量。

2.1.2.2对照品溶液的制备 精密称取芦荟大黄素4.51 mg、大黄酸4.42 mg、大黄素4.33 mg、大黄酚1.58 mg和大黄素甲醚2.16 mg，分别置于10 ml量瓶中，加入适量甲醇，超声使溶解，加甲醇定容至刻度，得5种大黄蒽醌类成分的对照品储备液。精密量取大黄素甲醚对照品溶液5 ml，其余4种对照品储备液各10 ml，置于50 ml量瓶中，加入适量甲醇，超声混匀，加甲醇定容至刻度，得上述5种大黄蒽醌类成分质量浓度分别为90.20、88.40、31.60、85.60和21.60 mg/L的混合对照品溶液。

2.1.3标准曲线的绘制 取上述混合对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样1、2、5、8、10、15和20 μl，记录峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，回归方程及线性范围见表1。

2.1.4精密度考查 将混合对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.6%、0.6%、0.3%、0.8%和0.3%，表明仪器精密度良好。

表1 5种大黄蒽醌类成分的回归方程及线性范围

2.1.5稳定性考查 将大黄药液放置0、4、8、12、16、20和24 h后，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为2.0%、2.7%、0.4%、0.5%和2.4%，表明大黄药液在24 h内稳定。

2.1.6重复性考查 精密量取大黄药液适量，按“2.1.2.1”项下方法各制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果大黄游离蒽醌供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的质量浓度平均值分别为113.12、128.34、38.17、3.61和2.98 μg/ml，RSD依次为0.7%、1.0%、0.8%、0.7%和0.5%；这5个成分在大黄总蒽醌供试品溶液中的质量浓度分别为591.54、305.94、160.22、117.69和51.52 μg/ml，RSD依次为0.5%、1.3%、1.1%、0.9%和0.8%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7加样回收率考查 取大黄药液适量，分别精密加入一定量的5种大黄蒽醌类成分混合对照品溶液，按“2.1.2.1”项下方法制备总蒽醌供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率及其RSD。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率分别为99.52%、99.20%、98.67%、99.97%和98.99%，RSD分别为0.6%、0.7%、1.5%、1.1%和2.1%，见表2-表6。

表2 芦荟大黄素加样回收率试验结果

2.2大黄药材中蒽醌的含量测定 取本品粉末(过四号筛)约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量[7]，按照“2.1”项下含量测定方法，测得游离蒽醌和总蒽醌含量百分数分别为0.22%和2.06%，符合大黄质量标准要求。

表3 大黄酸加样回收率试验结果

表4 大黄素加样回收率试验结果

表5 大黄酚加样回收率试验结果

表6 大黄素甲醚加样回收率试验结果

2.3影响大黄结合蒽醌提取的因素考查 试验选择结合蒽醌转移率和游离型与结合型蒽醌比例作为指标，主要对乙醇浓度，溶剂体积，是否浸泡及提取时间几个因素进行考查，筛选出最佳的提取条件。

2.3.1不同乙醇浓度对大黄结合蒽醌提取的影响 取大黄饮片3份，每份10 g，分别加入10倍量的水、30%乙醇和50%乙醇，加热回流，提取3次，每次0.5 h，过滤，合并3次滤液，按照“2.1”项下含量测定方法制备供试品溶液并检测各蒽醌含量。结果见表7。

表7 乙醇浓度对结合蒽醌成分提取的影响

结果表明，选用50%乙醇提取得到的结合蒽醌转移率最高，水提取的与之相差不大，水提取的游离与结合蒽醌比例最理想，同时考虑到后期乙醇回收也会降低结合蒽醌含量，以及成本等问题，故选择水作为提取溶剂。

2.3.2不同溶剂体积对大黄结合蒽醌提取的影响 取大黄饮片4份，每份10 g，分别加入5、10、15和20倍量的水，加热回流，提取3次，每次0.5 h，过滤，合并3次滤液，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液并测定各蒽醌含量。结果见表8。

表8 溶剂体积对结合蒽醌成分提取的影响

结果表明，10倍量提取的药液结合蒽醌转移率与游离结合蒽醌比例均为最优，故选择10倍量水提取。

2.3.3是否浸泡及提取时间对大黄结合蒽醌提取的影响 取大黄饮片4份，每份10 g，分别加入10倍量的水，两份浸泡过夜，另外两份不浸泡，按表9中条件加热回流，提取3次，过滤，合并3次滤液，按照“2.1”项测定方法制得供试品溶液并检测各蒽醌含量。浸泡过夜提取的药液中游离蒽醌含量明显升高，结合蒽醌含量明显降低，故选用不浸泡提取。不浸泡条件下，每次煎煮30 min的结合蒽醌转移率与游离结合蒽醌比例均明显优于每次煎煮20 min，故选用不浸泡，每次提取30 min。

根据单因素试验结果确定工艺为：大黄饮片加入10倍量的水，加热回流提取3次，每次0.5 h。大黄药液中结合蒽醌转移率可达37%，游离蒽醌与结合蒽醌的比例为1∶21。结果见表9。

表9 是否浸泡及提取时间对结合蒽醌成分提取的影响

3 讨论

近年来大黄的提取工艺主要有超声法[8-10]、渗漉法[11-14]、醇提法[15-18]、水提法[19，20]和超临界CO2萃取法[21，22]等，但超声法工作噪音较大，对人体有一定的危害[23]，渗漉法周期长，工序多，提取效率较低[24]，超临界CO2萃取法需要专业的提取仪器，运行成本过高，推广应用困难[25]，故本试验对醇提法和水提法进行了条件筛选。其中关于煎煮时间的设定，因结合蒽醌受热时间过长会被破坏，含量降低，故煎煮时间不宜过长[26]。试验发现，大黄药材浸泡前后游离和结合蒽醌含量差异明显，如果以提取结合蒽醌为目的，建议大黄药材不浸泡提取，浸泡后，提取的游离蒽醌含量较高，推测是浸泡一段时间后，大黄中的结合蒽醌可能部分被水解了。前人有关于大黄结合蒽醌的提取[27]，其采用紫外分光光度法测定结合蒽醌的含量，因其检测手段不够准确，且大黄药材中蒽醌含量高低不一，相较于考查大黄结合蒽醌的含量，选用高效液相色谱法测定蒽醌含量进而计算结合蒽醌转移率显然更具有参考价值。本试验考虑到大黄结合蒽醌的转移率，游离与结合蒽醌的比例及成本等因素，对大黄提取条件进行了筛选，最终确定了其提取工艺，为工业大生产提供参考。

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