刺络泻血疗法对高脂血症大鼠模型ApoCⅢ及LPL的影响

张博 赵慧玲 魏丹蕾 曾蕊 张书鹏 崔艳芝 曹范锡

摘要 目的：观察刺络泻血疗法对高脂血症模型大鼠载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）及脂蛋白酯酶（LPL）活性的影响，并探讨其作用机制。方法：将34只清洁级雄性SD大鼠分为空白组、模型对照组、立普妥组及刺络泻血组，每组8只，以高脂饲料喂养造模，造模持续28 d。第4周造模成功后，各造模组仍给予高脂饲料喂养，空白组不进行任何干预；模型组仅抓取按压处理，2次/周；立普妥组按照1.8 mg/（kg·d）的剂量给大鼠灌胃阿托伐他汀钙，2次/周；刺络泻血组选取大鼠委中穴及足三里穴穴位附近的血络，出血量为0.3～0.5 mL，至第8周。第9周腹主动脉取血，采用酶联免疫吸附法测定ApoCⅢ，采用光谱检测法测定LPL、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。结果：实验结束后，与正常组比较，模型组ApoCⅢ、TC、LDL-C含量均显著增高，差异有统计学意义（P<0.05），LPL含量无明显变化（P>0.05）；与模型组比较，刺络泻血组与立普妥组ApoCⅢ、TC、LDL-C含量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05），LPL含量无明显变化（P>0.05）。结论：刺络泻血疗法可以有效抑制ApoCⅢ活性，降低高脂血症大鼠TC、LDL-C水平，还不能认为对LPL有干预作用。

关键词 高脂血症；刺络泻血；载脂蛋白；脂蛋白脂肪酶

Abstract Objective：To observe the effects of pricking blood therapy on ApoCⅢ and LPL in hyperlipidemia rats and explore its mechanism. Methods：A total of 34 male SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group， model group， lipitor group and blood pricking therapy group， with 8 in each group. Hyperlipidemia model was induced by high fat diet for 28 days. After successful modeling of 4 weeks， each group was still given high fat diet except control group. Rats in normal group didn′t accept any interventions， while the model group was treated with grabbing and pressing， twice per week. The lipitor group was given atorvastatin calciumby intragastric administration with 1.8 mg/（kg·d） each time， twice per week. In the blood pricking therapy group， the superficial vein of Weizhong and Zusanli were selected for 0.3 to 0.5 mL bleeding until the eighth week. Blood was collected from the abdominal aorta on the 9th week， and ApoCⅢ was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The levels of LPL， TC， TG， HDL-C and LDL-C were measured by spectrophotometry. Results：Comparing with the control group， the level of TC， LDL-C and ApoCⅢ of the model group were significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Compared with the model group， the level of TC， LDL-C and ApoC3 of the blood pricking therapy group and lipitor group decreased significantly， and the differences were statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Conclusion：Blood-letting therapy can effectively inhibit the activity of ApoC III and reduce the levels of TC and LDL-C in hyperlipidemia rats， but it cannot be considered as an intervention to LPL.

Key Words Hyperlipidemia； Blood pricking therapy； ApoCⅢ； LPL

中圖分类号：R245.31+2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.036

近年来，随着人们生活习惯特别是饮食习惯的改变等多种因素的影响，高脂血症的发病率有明显増高的趋势，对我国健康人群血脂水平的调査发现，男女、城乡人群的TG和T-CHO水平都较以往升高[1]。高脂血症是AS和冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）的独立危险因素，其中，LDL-C是导致AS的基本因素[2-3]。高脂血症是危及人类生命和健康的主要疾病之一，是人类健康的隐形杀手，其严重性不容忽视。加强对血脂的控制可以降低CHD及其他心血管疾病发生的概率，JAMA杂志曾经发表述评，认为高质量的脂质处理和血运重建同样重要，降低血脂可以延缓AS的进展[4]。有效数据证明，有效控制血脂异常，能够降低患者的住院率化及病死率、提高存活率。高脂血症患者主要推荐药物治疗，虽然西药的调脂作用疗效较好，但一旦停药则疗效减低甚至消失，而长期应用伴有多种不良反应。因此寻找安全、有效、作用持久的方法治疗高脂血症，尤其探索科学合理的治疗高脂血症的临床治疗方案就显得非常重要。本研究基于刺络泻血疗法“祛瘀生新”理论[5]，在高脂血症模型大鼠造模成功后，刺血足三里穴和丰隆穴对模型大鼠进行干预。通过观察实验中高脂血症模型大鼠的载脂蛋白CⅢ（Apo CⅢ）及脂蛋白脂肪酶（LPL）的变化，分析刺络泻血疗法对高脂血症模型大鼠Apo CⅢ以及脂蛋白脂肪酶（LPL）的影响，研究刺络泻血疗法治疗高脂血症的具体机制，为防治由血脂水平异常引起的心脑血管疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性SD大鼠34只，体重（200±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2016-0011。在2级动物室（北京中医药大学实验针灸动物室：室温22 ℃，相对湿度45%）清洁条件下喂养。

1.1.2 药物 高脂饲料（82.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶，5%蛋黄粉和1%胆酸钠，由北京科澳协力饲料有限公司提供）；立普妥（阿托伐他汀钙，10 mg/片，辉瑞制药有限公司（国产），国药准字H20051407），使用前使用去离子水超声乳化，配制成1.8 mg/mL的溶液备用。

1.1.3 试剂与仪器 戊巴比妥钠（Sigma试剂公司，059H0612），碘酒（上海利康消毒高科技有限公司，20140718）；大鼠载脂蛋白C-Ⅲ（ApoCⅢ）酶联免疫试剂盒（武汉华美提供），大鼠脂蛋白脂酶（LPL）试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，总胆固醇（T-CHO）试剂盒，三酰甘油（TG）试剂盒（南京建成提供），小号三棱针，分光光度计（UV-2100尤尼柯）恒温水浴锅（HW·SY11-K 北京市长风仪器仪表公司）离心机（3K18 Sigma）标准规格酶标仪（Multiskan MK3 Thermo Scientific），自动洗板机（DEM-3北京拓普分析仪器有限公司），电热恒温培养箱（SKP-02.600黄石市恒丰医疗器械有限公司）电子秤（HOCKY AD05）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法将34只大鼠随机分为2组，空白组8只，模型组26只。参考Qi Zhang在Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects of Ginkgo biloba extract on diet-induced hyperlipidemia in rats中使用的造模方法对26只大鼠造模。4周后随机选取2只造模组大鼠腹主动脉取血，检查血浆中总胆固醇的含量≧5.2 mmol/L[6]，提示造模成功。然后将模型组大鼠随机分为模型对照组，刺络泻血组及立普妥组，每组8只。

1.2.2 干预方法 全部大鼠适应性喂养1周后，空白组：常规饲养8周，不做任何处理；模型对照组：高脂饲料喂养8周，从第4周后开始，去离子水灌胃，2次/周，不做其他处理；刺络泻血组：高脂饲料喂养8周，从第4周开始，去离子水灌胃，丰隆，足三里刺血，出血量为0.3～0.5 mL（换算公式为出血量=体重×7.4%×2%），2次/周；立普妥組：高脂饲料喂养8周，从第4周后开始，按照1.8 mg/（kg·d）立普妥灌胃，2次/周。

1.2.3 检测指标与方法 实验进行至第8周末，各组大鼠禁食24 h，使用6%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉后，腹主动脉部位取血，低温离心进行血清分离，置-20 ℃的冰箱保存，待用于ApoCⅢ、LPL、TC、TG、HDL、LDL的检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。各组数据以均数±标准差表示，各组方差齐且数据符合正态分布时用单因素ANOVA检验，组间比较用LSD法，方差不齐或非正态时用Welch检验或Nemenyi非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂4项的比较 实验8周后，各组大鼠血脂四项进行比较，与空白组比较，模型对照组的总胆固醇及低密度脂蛋白显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），刺络泻血组和立普妥组稍有升高，差异无统计学意义（P>0.05），与立普妥组比较，刺络泻血组总胆固醇及低密度脂蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠ApoCⅢ及LPL的比较 实验8周后，各组大鼠进行比较，与空白组比较，模型对照组的ApoCⅢ含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），刺络泻血组和立普妥稍有升高，差异无统计学意义（P>0.05），与立普妥组比较，刺络泻血组ApoCⅢ差异无统计学意义（P>0.05），各组LPL含量无明显差异，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

国家卫生与计划生育委员会2015年初发布的《中国居民营养与慢性病调查报告》[7]显示，2012年中国成人血脂异常患病率40.40%，比较2002年的患病率水平出现大幅度增加，其中高胆固醇血症患病率4.9%，高脂血症的患病率13.1%，低高密度脂蛋白胆固醇血症的患病率33.9%，呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态。

临床上血脂检测的基本项目为TC、TG、LDL、HDL。国内外血脂异常防治指南均强调，LDL在AS的发病中起着核心作用，因此推荐LDL为首要干预靶点[3，8-9]，胆固醇占LDL比重的50%左右，故LDL-C浓度基本能反映血液LDL总量，那么以LDL-C作为评估一种治疗方法对于高脂血症的干预效果指标，无疑是合适的。在本次实验中，我们发现刺络泻血疗法的确对高脂血症有明确的治疗效果，而战慧敏[10]等在刺络泻血对高脂血症模型大鼠血脂、NO及ET-1影响的研究中也明确了，刺络泻血疗法对于高脂血症模型大鼠的血脂有明确的干预作用。为探究该疗法如何调控大鼠体内的LDL，本实验选取了ApoC3及LPL作为研究目标。通过本次实验，发现刺络泻血疗法能明显降低ApoC3的含量，但是对于LPL无明显调节作用。

载脂蛋白CⅢ（Apolipoprotein CⅢ，Apo CⅢ）是脂蛋白代谢的重要调节蛋白之一，其主要作用是抑制具有水解血浆三酰甘油（Triglyceride，TG）功能的脂蛋白酯酶活性，并可干扰受体依赖或者非依赖途径的肝脏对富含TG脂蛋白的摄取，并可促进极低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）在肝脏的组装和分泌。Apo CⅢ抑制富含TG的脂蛋白（TRLs）的分解和清除。无论是在体内还是在体外CM和VLDL中Apo CⅢ可以抑制肝细胞对CM和VLDL的摄取。Apo CⅢ抑制脂蛋白ApoB和肝细胞上的ApoB或ApoE受体的结合。Apo CⅢ的这种抑制作用是由于Apo CⅢ对ApoB或者ApoE的受体区域的掩盖。Apo CⅢ也可以抑制脂蛋白酶（LPL）的活性，并且在高TG血症的患者中，Apo CⅢ也是LPL的一个明确的抑制剂。缺乏Apo CⅢ的受试对象TRL水平较低，来自这些受试对象的血清可以激活人奶中的LPL，但是正常的血清可以有效地抑制LPL的活性。这些发现表明Apo CⅢ是通过抑制LPL介导的TRLs的脂解作用导致高TG血症的发展。

ApoC3能促进VLDL的组装与分泌，而LDL正是从VLDL转化而来，并且ApoC3能抑制LDL被干细胞膜上LDL受体的摄取，从而导致血液中LDL的升高，这正与本次实验的数据相符合。说明刺络泻血疗法可能是通过抑制血浆中ApoC3的含量，间接的调控血浆中LDL的含量，并且可能对LDL的含量有直接的调控作用。本次实验中，并未体现LPL的含量有明显的变化，在与空白组比较，模型组、刺络泻血组、立普妥组中，LPL的含量变化基本一致，差异无统计学意义。

LPL全称为三脂酰甘油蛋白脂酰基水解酶（Triacylglyc-roprotein Acylhydrolase），是由LPL基因编码的糖蛋白。1966年由Scanu在高密度脂蛋白研究中命名。成熟LPL是由448个氨基酸组成的糖蛋白，相对分子质量为55 000。LPL蛋白以单体和二聚体2种形式存在，活性形式为通过非共价键结合形成的同二聚体，其催化中心由Ser132、Asp156、His241组成，LPL的酶活性必须由辅因子载脂蛋白CⅡ（apoCⅡ）激活，载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）则抑制LPL酶活性。健康人血浆中LPL活性低，静脉注射肝素后血浆中LPL活性明显增加。LPL主要由脂肪细胞、心肌、骨骼肌等肝外实质细胞合成分泌，释放入血后，借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖结合在毛细血管内皮上。LPL的生物作用复杂，血浆中LPL是TG代谢的限速酶，LPL的二聚体水解血液中富含TG的乳糜微粒和极低密度脂蛋白，生成的甘油、脂肪酸可供组织氧化分解并提供能量；LPL将脂蛋白结合到血管壁上，促进TG的水解及脂蛋白颗粒的摄取；LPL还可作为LDL受体的配体；LPL参与磷脂和载脂蛋白向高密度脂蛋白的转移。LPL含量或者活性的改变可通过影响TG代谢进而影响到高脂血症的发病。

Heller[11]等报道阿托伐他汀未改变高脂血症个体LPL活性，表明此药物降低TG不是由此酶加强对TG饱和脂蛋白的分解作用。Kobayashi[12]等的研究结果表明，21名高脂血症患者服用阿托伐他汀6周后，血浆LPL未见明显改变。

通过本次实验，还不能说明刺络泻血疗法对LPL有调控作用。通过实验比较研究发现，与目前临床使用他汀类降脂药物比较，所有强化他汀治疗的临床研究结果均表明，数倍增量他汀确实可使AS时间发生危险有所降低，但获益的绝对值小，且全因死亡并未下降[13]，在临床上，根据导师的临床经验发现，长期服用他汀类药物的患者，虽然可以有效控制血脂中LDL的含量，但是却有明显的食欲减退，乏力，反酸等不良反应，而本疗法在有效降低LDL的含量的同时，不仅治疗的次数少，而且并未出现其他的不良反应，明显优于他汀类药物，缺点在于本疗法在治疗过程中，不如他汀类药物降低血脂迅速，如血脂过高，需要快速降低血脂指数，建议优先选择他汀类药物治疗，并联合本疗法，在后期治疗中可以替代他汀药物，以减轻他汀类药物的不良反应及停药后的血脂升高。

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