刺络泻血对非酒精性脂肪肝模型大鼠瘦素及脂联素的影响

曾蕊 魏丹蕾 张博 张书鹏 崔艳枝 赵慧玲

摘要 目的：觀察刺络泻血干预对非酒精性脂肪肝模型大鼠血清中瘦素及脂联素的影响。方法：选取清洁级雄性SD大鼠40只，随机分为正常组（10只），模型组（10只），易善复组（10只），刺血干预组（10只）。选用高脂饮食饲料喂养法建立非酒精性脂肪肝模型。造模8周后，各造模组仍给予高脂饲料饲养，易善复组给予易善复0.159 g/（kg·d）灌胃，刺血干预组予“丰隆”“太冲”穴三棱针刺血，治疗4周后取材，观察4组大鼠肝指数及肝脏病理变化，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清瘦素、脂联素的水平。结果：与正常组比较，模型组血清瘦素水平显著升高，脂联素水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，易善复组及刺血干预组瘦素水平明显下降，血清脂联素水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与易善复组比较，刺血干预组瘦素水平稍高，血清脂联素水平则稍低，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：刺血干预可显著减轻非酒精性脂肪肝大鼠模型肝损伤，其机制可能与降低血清中瘦素水平，上调脂联素水平有关。

关键词 刺血干预；非酒精性脂肪肝；瘦素；脂联素；易善复；肝损伤；高脂饮食饲料喂养法；肝脏病理

Abstract Objective：To investigate the effects of pricking blood therapy on serum level of leptin and adiponectin in non-alcoholic fatty liver model rats， and to explore the mechanism of pricking blood intervention on non-alcoholic fatty liver disease. Methods：Forty male SD rats were randomly divided into normal group （n=10）， model group （n=10）， essentiale group （n=10） and pricking blood group （n=10）. The non-alcoholic fatty liver model was established by high fat diet feed. After 8 weeks of modeling， the model groups were still fed with high-fat diet. Essentiale group was treated with Polyene Phosphatidylcholine Capsules 0.159 g/（kg·d）， and the pricking blood group was treated with pricking blood therapy on Fenglong （ST40） and Taichong （LR3）. The liver index and liver pathological changes were observed after 4 weeks of treatment. The levels of serum leptin and adiponectin were measured by ELISA. Results：Compared with the normal group， the serum leptin level in the model group was significantly increased， and the content of adiponectin was significantly decreased. And the difference was statistically significant （P<0.05）； Compared with the model group， the serum leptin level in the essentiale group and the pricking blood group was significantly decreased， and the content of adiponectin was significantly increased （P<0.05）. The difference was statistically significant （P<0.05）； Compared with Essentiale group， the leptin level was slightly higher in the pricking blood group， and the adiponectin content was slightly lower. The difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion：This study shows that pricking blood therapy can significantly reduce liver injury in rats with non-alcoholic fatty liver disease. The mechanism may be related to down-regulating the serum level of leptin and up-regulating the adiponectin.

Key Words Pricking blood therapy； Non-alcoholic fatty liver； Leptin； Adiponectin， Essentiale， Liver injury， High fat diet feed， Pathological changes of the liver

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.039

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外乙醇和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床综合征[1]，是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤[2]。近年来，NAFLD的发病率正逐步上升，已成为我国最常见的慢性肝病之一[3]。目前研究认为其发病机制与氧化应激、脂质代谢紊乱、脂肪细胞因子失调等因素密切相关[4]。瘦素（leptin，LP）、脂联素（adiponectin，ADP）是脂肪细胞分泌的一种细胞因子，其分泌异常与脂肪肝的形成和发展密切相关[5]。此病属中医“痰证”“瘀证”“肥气”“积证”等范畴，痰湿内阻，肝郁气滞为主要病机[6]。多由于肝失疏泄，脾失健运，导致痰浊内蕴，湿邪内生，血行不畅，进一步引起肝络不和，肝脾功能失调，湿痰瘀互结于肝而致，临床多用活血化瘀、祛痰化湿等方法治疗[7]。中医传统医学中刺血干预对治疗痰瘀类疾病疗效确切，但目前尚未有刺血干预治疗非酒精性脂肪肝病的相关报道。为探究刺血干预对非酒精性脂肪肝病的疗效及可能的作用机制，本研究以高脂饲料喂养法建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，采用酶联免疫吸附试验检测血清中LP及ADP的水平作为观察指标。通过观察实验4组大鼠血清中的LP及ADP水平的变化，对刺血干预治疗非酒精性脂肪肝模型大鼠血清LP及ADP的影响进行评估，探索“丰隆”“太沖”刺血干预疗法对非酒精性脂肪肝病模型大鼠治疗作用的可能起效机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用清洁级健康雄性SD大鼠40只（北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK[京]2016-0011），体重180～200 g。所有动物购入后，于清洁级动物房适应性饲养1周。利用随机数字表制定随机分组方案，随机分为正常组10只，模型组10只，刺血干预组10只，易善复组10只。采用每笼5只群养，自由饮用去离子水与光照节律12 L：12 D（7：00-19：00），室温（22±2）℃，相对湿度保持30%～40%，并保持动物室安静。（质量检测单位：北京维通利华实验动物技术有限公司。最近1次质量检测日期：2017年01月24日）。

1.1.2 药物 高脂饲料（由100 g/L猪油、20 g/L胆固醇和880 g/L普通饲料混合而成，由科澳协力公司提供）；易善复胶囊（多烯磷脂酰胆碱胶囊，赛诺菲安万特（北京）制药有限公司，批号：D9073），使用前采用去离子水超声乳化，并配制为含多烯磷脂酰胆碱132.4 g/L的溶液备用。

1.1.3 试剂与仪器 戊巴比妥钠（Sigma试剂公司，059H0612），碘酒（上海利康消毒高科技有限公司，20140718）；大鼠瘦素（LP）酶联免疫试剂盒，大鼠脂联素（ADP）酶联免疫试剂盒（由上海酶联有限公司提供）；小号三棱针。Multiskan MK3型标准规格酶标仪（Thermo Scientific公司）；DEM-3型自动洗板机（北京拓普分析仪器有限公司）；SKP-02.600型电热恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；3K18型离心机（Sigma公司），电子秤（HOCKY AD05公司）。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝大鼠模型建立与分组 采用陈世清等[8]高脂饲料的制备配方，即喂养由10%猪油、2%胆固醇和88%普通饲料混合而成的高脂饲料。通过高脂饮食8周建立脂肪肝大鼠模型。选用清洁级雄性SD大鼠40只，随机分为正常组（10只），模型组（10只），易善复组（10只），刺血干预组（10只）。

1.2.2 模型评价方法 4组大鼠于第12周取材，快速剥取相同部位的肝组织，进行苏木精-伊红（HE）染色后，在光镜下进行肝组织病理变化的观察，以《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[9]作为诊断标准，确定造模成功。

1.2.3 干预手段 正常组大鼠每日以基础饲料喂养，至12周。模型组于造模8周后继续喂养高脂饲料，不给予任何治疗，只抓取按压。刺血干预组于第8周造模后继续喂养高脂饲料，并进行治疗性干预：将大鼠放置大鼠固定器中固定，并绑住其四肢便于操作，取双侧丰隆、太冲（依林文注所著《实验针灸学》[10]和比较解剖学法进行取穴）刺血0.25 mL，进行刺血干预治疗，2次/周，至第12周。易善复组于8周造模成功后继续喂养高脂饲料，并给予易善复胶囊灌胃，0.159 g/（kg·d）[11]，同时给予正常组、模型组、刺血干预组相同体积（1.2 mL/kg）的去离子水灌胃，至12周。

1.2.4 取材

1.2.4.1 血清采集 实验第12周末，4组大鼠禁食24 h，称重，使用6%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉后，腹主动脉部位取血，低温离心进行血清分离，置-20 ℃的冰箱保存。

1.2.4.2 肝脏采集 动物麻醉后，打开腹腔，迅速取出肝脏，称湿重。每只均取肝左叶取相同部位的肝组织3块，并将其浸入4%多聚甲醛溶液，固定48 h，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下进行病理观察。

1.2.5 观察指标与方法

1.2.5.1 肝指数测定 采血后快速摘取肝脏并称取其质量，计算肝指数，脏器指数=脏器湿重/动物体重。用各大鼠的脏器湿重除以动物体重，即为4组大鼠的肝指数。

1.2.5.2 肝脏病理结构检查 取肝左叶，4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色光镜下观察，计算机彩色成相系统照相。

1.2.5.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中LP、ADP的水平 按ELISA试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，4组数据以（±s）表示，4组方差齐且数据符合正态分布时用单因素方差分析，组间比较用LSD法，方差不齐或非正态时用Nemenyi非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠肝指数比较 实验12周后，4组大鼠称重并进行比较，与正常组比较，模型对照组、刺血干预组及易善复组大鼠体重偏低，差异有统计学意义（P<0.05）。4组大鼠肝指数比较，与正常组比较，模型组显著增高，差异有统计学意义（P<0.05），刺血干预组和易善复组稍高，但差异无统计学意义（P>0.05）；与易善复组比较，刺血干预组肝指数差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 4组HE染色情况 肉眼观察正常组大鼠肝脏呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑；模型组肝脏体积增大，边缘变钝，呈土黄色，切面呈油腻状；刺血干预组以及易善复组部分肝脏接近正常，表面呈浅黄色，油腻状相对减轻，指压有弹性。HE染色显示：正常组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞形态大小均正常，无变性、坏死、炎性细胞浸润及纤维组织增生。模型组大鼠肝细胞的胞质内存在大量的呈透明状的脂肪空泡，且这些脂肪空泡将细胞核挤到肝细胞边缘，证实病理脂肪肝形成，提示造模成功。刺血干预组以及易善复组通过分别接受刺血干预和药物治疗以后，肝脏脂肪组织变性在一定程度上有所减轻，而肝细胞的结构基本趋于正常。见图1。

2.3 4组大鼠血清LP、ADP比较 与正常组比较，模型组血清瘦素水平显著升高，脂联素水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，刺血组及易善复组瘦素水平明显下降，血清脂联素水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与易善复组比较，刺血组瘦素水平稍高，血清脂联素水平则稍低，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

NAFLD是当前全球面临的巨大且不断增长的疾病[12]，也是全球日益普遍的慢性肝病[13]。目前本病的治疗主要包括基础治疗，例如改变生活方式[14-15]，减少体重，适当运动和适度限制热量的饮食等[16]，药物治疗包括保肝药物治疗和降脂药物治疗，其中联合使用胰岛素增敏剂和保肝药物或抗炎抗纤维化药物是当前治疗NAFLD有前景的方向[17]。易善复作为临床常用药治疗非酒精性脂肪肝，其作用于肝细胞，通过与肝细胞膜及细胞器膜相结合，可以加速体内脂肪分解以减少脂肪在体内积聚。通过直接影响膜结构使受损的肝功能和酶活力恢复正常，促进肝组织再生，调节肝脏的能量平衡。

中医学认为本病属于中医“瘀证”“积证”“肥气”等范畴，肝主疏泄、肝气郁结和脾失健运是本病的病机，进而可致痰湿内蕴，气机郁滞，最终导致痰湿瘀积互结于肝。《素问·肝热》曰：“肝热者，刺足厥阴”，太冲既为足厥阴肝经输穴又是原穴，丰隆为“祛痰要穴”，二穴合用可以调畅气机，行气化痰，和肝醒脾，临床上多用太冲，丰隆治疗非酒精性脂肪肝。有研究表明，针刺太冲，丰隆可以通过改善胰岛素抵抗状态治疗NAFLD[18]。刺血疗法早在《黄帝内经》中就有相关记载，又称泻血疗法、刺络泻血疗法，主要指采用三棱针或其他针具刺破身体之细小络脉或小静脉，放出一定量的血液以治疗疾病的一种传统医学方法[19]。有研究证明通过静脉放血可明显降低铁负荷，有效改善胰岛素水平和胰岛素抵抗，从而减轻肝脏损伤[20]。

瘦素（LP）是由肥胖基因ob编码，脂肪细胞分泌的因子，在体重和脂肪量的调节起着至关重要的作用。而瘦素抵抗亦为肥胖和诸多代谢性疾病的重要发病因素[21]。LP在肥胖小鼠种能引起体重减轻、增加能量消耗和脂肪酸的氧化，降低食欲和三酰甘油的合成和抗胰岛素的脂肪合成作用。近年研究表明，LP在调节细胞凋亡中起关键作用，高瘦素水平可能会促进胰岛素抵抗，游离脂肪酸（FFA）因胰岛素信号传导的异常在肝细胞中堆积而加重脂肪肝[22]。脂聯素（ADP）是由脂肪细胞分泌的胰岛素敏感性脂肪因子，ADP水平降低是NAFLD及肝功能障碍的独立危险因子。ADP水平降低NAFLD的发病机制中起着举足轻重的作用。LP在促进炎性反应及肝纤维化的过程中起主要作用，而ADP能抑制氧化应激，使胰岛素抵抗及炎性反应得到改善。

高脂饲料喂养法是非酒精性脂肪性肝病研究中常用的造模方法，陈世清等[8]通过高脂饲料成功建立了稳定的胰岛素抵抗模型。胰岛素抵抗是导致非酒精性脂肪肝的关键因素，LP与ADP和脂肪组织及脂肪蓄积密切相关，提示其参与非酒精性脂肪性肝病的病因和发病机制[23]。本实验选用高脂饲料喂养8周，制成非酒精性脂肪肝大鼠模型，并采用易善复和刺血疗法进行干预，实验结果显示：与正常组比较，模型组血清LP水平显著升高，ADP水平显著降低；与模型组比较，药物组及刺血干预组LP水平明显下降，血清ADP水平明显升高；与药物组比较，刺血干预组LP水平稍高，血清ADP水平则稍低。进一步表明刺血干预可显著减轻非酒精性脂肪肝大鼠模型肝损伤，有效地减少脂肪的合成，主要表现为减少血清中LP水平，上调ADP水平，降低肝脏质量、肝脏指数及改善体重，从而减少肝脏脂肪的堆积，达到治疗非酒精性脂肪肝的目的。故有关刺血干预对非酒精性脂肪肝的保护机制，可能与下调血清中LP水平，上调ADP水平有关。而刺血干预除了与易善复有着类似的改善脂质代谢异常有关外，还可能与间接改善IR这一机制密切相关。本研究表明刺血干预对NAFLD的形成及进展过程具有延缓作用。李玥等[24]采用刺血干预治疗非酒精性脂肪性肝病67例，临床总疗效总有效率为88.24%，显示刺血干预可显著改善脂肪肝超声影像学，显著降低TG、TC水平，获得较好疗效。

本研究采用“丰隆”“太冲”对非酒精性脂肪肝模型大鼠进行刺血干预研究刺络泻血对非酒精性脂肪肝病的治疗作用，其机制可能是通过提高NAFLD大鼠肝脏内脂联素水平，降低LP水平，促进机体自身对IR的改善能力，起到减少肝脏脂质的沉积，阻止脂肪肝的进展有关。目前刺血疗法推广较少，其深入治疗机制有待进一步研究，刺血干预作为一个治疗非酒精性脂肪肝新的疗法，具有不良反应低、安全可靠等特点和优点，对刺血干预治疗非酒精性脂肪肝病的进一步研究将为NAFLD、胰岛素抵抗以及代谢综合征提供新的治疗思路与方法。

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