无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

罗伟 甘西 朱佳杰 敖秋桅 谭芸 陈明 罗永巨

摘要：【目的】确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官，为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。【方法】分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官。【结果】3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其中，腹腔注射和经口灌胃在感染2 h后即出现病理变化，而体外浸泡感染方式出現病理变化的时间约在感染5 h后，且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻。免疫组织化学定位发现，腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠，经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏，体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠。【结论】采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现。因此，自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施。

关键词： 吉富品系尼罗罗非鱼；无乳链球菌；致病途径；靶器官；免疫组织化学

中图分类号： S941.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0375-08

0 引言

【研究意义】无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是广泛存在于自然界中的条件致病菌，可危害水产养殖中的不同鱼类品种，包括罗非鱼（Oreochromis niloticus）、卵形鲳鯵（Trachinotus ovatus）、斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）、石斑鱼（Epinephelus sp.）等（Jafar et al.，2008；Amal et al.，2012；刘溪等，2015；郭长明等，2017；张德锋等，2017）。自2009年以来，随着罗非鱼规模化养殖模式的大面积推广，其病害日趋严重，尤其是无乳链球菌病危害呈逐渐递增趋势。该病死亡率高，传播速度快，但至今尚未找到完全根治的方法。因此，亟待开展罗非鱼抗病品系选育研究以保障其产业的健康持续发展，而开展罗非鱼抗无乳链球菌病育种的前提必须明确罗非鱼对无乳链球菌侵染的免疫应答机制。【前人研究进展】目前，有关病原菌感染鱼类的免疫应答机制研究已有报道。Skirpstunas和Baldwin（2002）研究发现，爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）通过肠道上皮细胞侵入斑点叉尾鮰体内，从而引起肠道败血症；Co-tter等（2005）研究发现，海豚链球菌（Streptococcus iniae）最先感染罗非鱼的胃肠组织，随后通过局部扩散作用进入血液循环系统，最后进入神经中枢系统而引发脑膜炎等症状；Tu等（2010）研究证实，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）通过肠道感染鲤鱼（Cyprinus carpio），且感染5周后还能从其肠道中分离出病原菌；但郭松林等（2011）研究发现，嗜水气单胞菌感染欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）时最先出现在肾脏组织，随后通过循环系统扩散至全身而引发病症；张永华（2012）采用实时荧光定量PCR检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染斑马鱼（Danio rerio）前后IL-1β、IFN和TNF的mRNA转录水平，结果表明，3种炎性细胞因子的表达水平与感染方式密切相关，但随着感染时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势；Peatmana等（2013）研究证实，柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）感染斑点叉尾鮰的第一靶器官是鳃组织；季策（2017）研究表明，Notch1a在Notch信号通路中可能通过抑制irak家族及NFκB家族基因而抑制TLR通路传导，在副溶血弧菌感染斑马鱼2 h时负向调节nfkbiaa、cxcl18b、cxcr3、il11r、c3a、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb等基因的表达，进而调控斑马鱼的天然免疫应答机制。【本研究切入点】目前国内有关罗非鱼无乳链球菌病的研究主要集中在病原菌分离鉴定（柯剑等，2010；郭玉娟等，2012）、毒力因子筛选（邓永强和汪开毓，2016；方伟等，2016）、药物防治（华亚南等，2016；梁志凌等，2016）及疫苗研发（李莉萍等，2015；王瑞等，2015）等方面，而针对其致病途径及感染后罗非鱼机体内组织的病理学研究报道甚少。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、肠、脾脏和肝脏组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其侵染的靶器官，为吉富品系尼罗罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试吉富品系尼罗罗非鱼取自广西南宁国家级罗非鱼良种场，SPF级成年兔购自广西医科大学实验动物中心，无乳链球菌株（HN016）由广西水产科学研究院鱼病防治研究室保存提供。HN016菌株解冻后直接接种于鸡血培养基上，30 ℃培养18～24 h，长出菌落后随机挑取单个菌落进行革兰氏染色，检测其是否携带杂菌；然后挑取单个菌落接种至200 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，摇床上32 ℃培养24 h，以无菌生理盐水稀释至1×107 CFU/mL，4 ℃保存备用。

1. 2 无乳链球菌感染方式

分别采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，感染试验鱼置于3 m3的水体大桶中养殖，水温控制在30～31 ℃，每天投喂膨化饵料2次，每隔3 d换水1次（1/2）。感染后每隔1 h观察统计1次罗非鱼的发病或死亡情况，并及时捞出病鱼、死鱼。

1. 3 病理形态学观察

采集无乳链球菌感染罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃和小肠等组织，以Bouins液进行固定，经梯度脱水、石蜡包埋切片和HE染色后（王晶等，2011），于显微镜下观察不同组织的病理变化。

1. 4 无乳链球菌免疫组化兔一抗血清制备

经复壮培养的HN016菌液用0.08%甲醛在28 ℃振荡器（300 r/min）上灭活过夜，以PBS将其浓度调至5×108 CFU/mL，与弗氏完全佐剂按1∶1混匀，即获得无乳链球菌HN016免疫原混合液。然后选取5只SPF级成年兔，在其背部皮下分点注射无乳链球菌HN016免疫原混合液（2.0 mL/只），保證每点注射量0.1～0.2 mL。第1次免疫后，每隔3周加强免疫1次，其方法与第1次免疫相同，共免疫3次。免疫期间提供充足的饲料和水源。3次免疫结束后，于兔耳中动脉采血，血样先倾斜置于37 ℃培养箱中保存一段时间（不超过1 h），再置于4 ℃冰箱过夜处理，然后在4 ℃下3500 r/min离心30 min，其上层血清即为免疫组化兔一抗血清，-80 ℃保存备用。

1. 5 免疫组织化学观察

包埋好的组织切片经脱蜡、水化后进行抗原修改，采用三步法DAB显色（夏永娟等，2000；郭松林等，2011），经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后于显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2. 1 病理形态学观察结果

病理组织切片观察发现，采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种感染方式均可使无乳链球菌侵入吉富品系尼罗罗非鱼体内。其中，腹腔注射和经口灌胃组的罗非鱼在感染2 h后即出现病变，而体外浸泡感染方式出现病变的时间约在感染5 h后，且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻。人工感染无乳链球菌后不同时间的吉富品系尼罗罗非鱼鳃、脾脏、肝脏及小肠组织病理变化如下：

鳃：腹腔注射组和经口灌胃组的吉富品系尼罗罗非鱼在感染2 h后，其鳃组织均已出现明显病理变化（图1-A和图1-B），主要表现为基部上皮细胞增生，黏液细胞分泌亢奋，有炎症细胞浸润，部分鳃小片增粗，其呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，基部与鳃软骨呈水肿性离散；感染5 h后，腹腔注射组和经口灌胃组均有罗非鱼表现出明显的临床症状，此时鳃组织病理变化十分严重，其基部上皮细胞大量增生，填满鳃小片间的间隙，大部分鳃小片的呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，黏液细胞分泌亢奋，有大量炎症细胞浸润（图1-C和图1-D）。体外浸泡组的吉富品系尼罗罗非鱼在感染5 h后鳃组织才出现明显病理变化（图1-E和图1-F），表现为部分鳃小片呼吸上皮细胞和柱状支持细胞坏死、崩解，其基部与鳃软骨呈水肿性离散，上皮细胞大量增生，填满鳃小片间的间隙，鳃小片增粗。

脾脏：腹腔注射组和经口灌胃组吉富品系尼罗罗非鱼的脾脏在感染2 h后即开始出现病理变化，表现为含铁血黄素增多，巨噬细胞呈弥漫性浸润，血管变细；感染5 h后脾小结增多变粗，大量细胞呈空泡变性，胞核溶解消失，脾脏内血管变窄或消失，血细胞下降（图2-A和图2-B）。体外浸泡组吉富品系尼罗罗非鱼的脾脏在感染5 h后才出现轻微病理变化，至感染8 h时病变加重，表现为含铁血黄素大量沉积，血管变窄变细，巨噬细胞大量增生且呈弥漫性浸润，中央动脉周围有大量红细胞浸润（图2-C）。

肝脏：腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼在感染2 h后，其肝脏呈现明显病理变化，表现为毛细血管扩张充血，肝细胞严重变形或坏死，肝细胞排列紊乱、胞核消失，甚至出现大面积的坏死灶（图3-A）。经口灌胃组吉富品系尼罗罗非鱼的肝脏在感染5 h后才出现明显病理变化，毛细血管明显充血，干细胞出现空泡变性或坏死，部分肝细胞的胞浆和胞核淡染，或溶解消失，仅剩下细胞轮廓，有的汇集形成明显的坏死灶（图3-B）。体外浸泡组吉富品系尼罗罗非鱼感染5 h后，其肝脏组织开始出现空泡变性，毛细血管充血破裂；感染8 h后肝细胞出现空泡，胞浆、胞核淡染（图3-C），部分区域空泡现象严重，且肝右叶空泡明显多于左叶，但整体的病变程度明显轻于同时期的腹腔注射组和经口灌胃组。

小肠：腹腔注射组和经口灌胃组吉富品系尼罗罗非鱼在感染2 h后，其小肠组织出现明显病理变化，表现为肠绒毛断裂，肠腔内有脱落的上表皮细胞和均质红染的蛋白渗出物，杯状细胞肿大，黏膜下层部分细胞的胞核、胞质溶解消失；感染5 h后上皮细胞大面积脱落，纹状缘消失，吸收细胞的胞膜溶解消失，肌层平滑肌纤维断裂，染色不均，或发生凝固性坏死，固有层与黏膜下层间的间质增宽，呈轻度水肿，有大量炎症细胞浸润（图4-A和图4-B）。体外浸泡组吉富品系尼罗罗非鱼的小肠组织在感染8 h后出现少量肠绒毛断裂现象（图4-C），至感染12 h时病理变化开始加重，肠腔内有脱落的上表皮细胞和均质红染的蛋白渗出物，杯状细胞肿大，黏膜下层部分细胞的胞核、胞质溶解消失，肌层纤维断裂（图4-D）。

2. 2 免疫组织化学观察结果

免疫组织化学观察发现，吉富品系尼罗罗非鱼鳃组织的病原菌阳性信号主要出现在鳃小片和基部上皮细胞及周边的毛细血管内（图5-A和图5-B）。脾脏的早期阳性信号主要出现在吞噬了无乳链球菌的吞噬细胞及其破裂坏死后的周边区域；随着感染时间的延长，在脾动脉血管及水肿病变的血管壁上也能观察到明显的阳性信号（图5-C和图5-D）；脾脏白髓区出现较强的阳性信号，说明迅速增殖的无乳链球菌已引发靶器官组织发生病理变化。肝脏阳性信号主要集中在肝血窦内及部分吞噬细胞破裂后的周边区域，少量阳性信号出现在病变坏死肝血窦周边的肝细胞和窦壁细胞内（图5-E和图5-F）。在肠道的结缔组织、浆膜层及黏膜下层均能检测到阳性信号（图5-G和图5-H），部分固有膜中也存在阳性信号；除此之外，阳性信号主要集中在含有吞噬细胞的毛细血管内。

无乳链球菌经腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式感染吉富品系尼罗罗非鱼后，其在试验罗非鱼鳃、脾脏、肝脏及小肠组织中的动态定位分布情况见表1。由表1可知，腹腔注射组和经口灌胃组吉富品系尼罗罗非鱼的4个组织器官在感染2 h后均能检测到病原菌阳性信号，其中，腹腔注射组以脾脏的阳性信号最强，经口灌胃组以小肠组织的阳性信号最强。体外浸泡组吉富品系尼罗罗非鱼在感染5 h后仅在鳃组织和脾脏中检测到阳性信号，且以鳃组织的阳性信号较强。根据病原菌阳性信号出现的时间顺序及其强弱分析可知，腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的阳性信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠，经口灌胃组的阳性信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏，体外浸泡组的阳性信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠。

3 讨论

3. 1 吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后机体组织器官的病理变化特征

无乳链球菌是罗非鱼养殖过程中的主要致病菌，具有传染快、致死率高、治疗困难等特点，但目前尚未明确无乳链球菌是通过何种途径从哪个靶器官侵入罗非鱼体内。本研究采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行人工感染无乳链球菌，通过观察鳃、脾脏、肝脏和小肠组织的病理变化，发现感染无乳链球菌的吉富品系尼罗罗非鱼全身组织器官呈广泛性充血和出血。鳃作为鱼体血液内循环与外界环境进行气体交换的主要场所（黄锦炉，2012），其病理变化主要是鳃小片上皮和基部细胞大量增生，且伴有变性甚至坏死脱落，大部分鳃小片增粗并黏连成棒状，阻碍其携氧能力，造成鱼体血液内循环氧气利用效率严重减弱甚至丧失，引发全身组织器官出现缺氧性的功能紊乱，进而加速病鱼死亡（Azad et al.，2012）。吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后，其脾脏肿大出血，且有大量含铁血黄素沉积，表明脾脏血管内的大量红细胞已遭到破坏（Chen et al.，2007；祝璟琳等，2014a），溶血现象严重，其造血功能受阻；同时鱼体的免疫抵抗力降低，进而加速病原菌在鱼体内的增殖。肝脏是鱼类的重要消化器官，在蛋白合成、机体血糖平衡维持和脂肪代谢调控方面发挥积极作用，还具有解毒和防御功能（祝璟琳等，2014b）。本研究发现感染无乳链球菌后的吉富品系尼罗罗非鱼肝细胞变性坏死、排列紊乱，说明肝脏代谢功能发生障碍，导致机体能量供应不足，进而影响其免疫机能。肠道是鱼类消化系统的重要组成部分。本研究发现感染无乳链球菌后的吉富品系尼罗罗非鱼小肠内容物已排空，肠道内大量积水，病理組织切片观察发现大部分上皮细胞变性坏死，说明鱼体的消化吸收功能受损，导致其摄食能力降低，严重者甚至停止进食，从而导致机体能量供应不足。

3. 2 无乳链球菌在感染吉富品系尼罗罗非鱼机体组织中的动态分布情况

目前，已有采用免疫组织化学技术研究病原菌侵入机体后在各组织器官分布规律的文献报道。夏永娟等（2000）利用免疫组织化学ABC法对鳗弧菌人工感染后的牙鲆肝脏和胃肠道组织进行致病菌定位研究；郭松林等（2011）利用免疫组织化学定位技术对感染后不同阶段嗜水气单胞菌在欧洲鳗鲡肝脏、肾脏和肠道内的分布规律进行研究。本研究利用免疫组织化学技术对吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后不同时间点的鳃、肝脏、脾脏及小肠组织进行病原菌信号检测，并根据其阳性信号出现的时间顺序及其强弱分析3种感染方式的侵袭过程，结果发现腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠，经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏，体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠。此外，本研究的预试验发现以高浓度的无乳链球菌体外浸泡感染吉富品系尼罗罗非鱼，其病原菌虽然可以侵入罗非鱼机体内，但并未表现出明显的发病症状和死亡现象。由此推测，自然养殖条件下罗非鱼感染无乳链球菌的最先靶器官是鳃组织，但其致病途径主要是摄食了携带有无乳链球菌的食物。

4 结论

采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现。因此，自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施。

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（責任编辑 兰宗宝）